標題奶粉中反式脂肪酸含量測定

摘要：本實驗室根據國標GB 5413.36—2010 《嬰幼兒食品和乳品中反式脂肪酸的測定》中提供的方法對奶粉中反式脂肪酸含量進行測定。實驗中首先用有機溶劑對奶粉中的脂肪進行提取，然后在堿性條件下對提取的脂肪進行甲酯化，形成脂肪酸甲酯。最后，再用配有氫火焰離子化檢測器的氣相色譜儀分離順式脂肪酸甲酯和反式脂肪酸甲酯，并進行外標法定量。

關鍵詞：反-9-十八碳一烯酸甲酯、反-9，12-十八碳二烯酸甲酯、外標法、脂肪

反式脂肪酸也稱反式脂肪，它可分為兩類：一類是天然的，存在于牛羊肉和牛羊奶中的反式脂肪；一類是人工制造的，是在動植物油脂加工和烹調過程中產生的。長期、過量食用反式脂肪酸，會嚴重危害人體健康。

“減少含反式脂肪酸食物的攝入”是衛生部一直在積極倡導的健康生活方式。嬰幼兒食品和乳品中反式脂肪酸含量較低，但長期食用會干擾嬰幼兒必需脂肪酸的利用，并造成中樞神經系統發育障礙，因此對食品中反式脂肪酸進行規定、監督、檢測其含量。

1         實驗部分

1.1    試劑及標準溶液配制

石油醚：沸程 30 ℃～60 ℃。

乙醚：分析純。

95 %乙醇：分析純。

正己烷：色譜純。

氨水：25 %～28 %，分析純。

氫氧化鉀：分析純。

甲醇：分析純。

無水硫酸鈉：分析純。

脂肪酸甲酯標準品：反-9-十八碳一烯酸甲酯（C18:1-9t）、反-9，12-十八碳二烯酸甲酯（C18:2-9t，12t）。

4 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液：稱取 26.4 g 氫氧化鉀，溶于約 80 mL甲醇中。冷卻至室溫，用甲醇定容至 100 mL，加入約 5g 無水硫酸鈉，充分攪拌后過濾，保留濾液。

標樣配制：

反式脂肪酸甲酯標準貯備液：濃度分別為 10.0 mg/ mL。稱取 100 mg（精確到 0.1 mg）反-9-十八碳一烯酸甲酯標準品和反-9，12-十八碳二烯酸甲酯標準品，分別用正己烷溶解并定容至 10.0 mL。放入冰箱在-15 ℃以下保存。

反式脂肪酸甲酯標準中間液：濃度分別為 1.0 mg/ mL。分別吸取兩種反式脂肪酸甲酯標準儲備液5.0 mL 入同一 50 mL 容量瓶中并用正己烷定容。臨用前配制。亦作為標準曲線最高濃度。

反式脂肪酸甲酯標準工作液：臨用前配制。分別吸取反式脂肪酸甲酯標準中間液，0、2.0、6.0、8.0、10.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，用正己烷定容，此濃度即為 0、0.2、0.6、0.8、1.0 mg/mL的標準工作液。

1.2儀器及工作條件

恒溫水�。�40 ℃～80 ℃

離心機：轉速≥4000 轉/分鐘

分析天平：感量為 0.1 mg

渦旋振蕩器

旋轉蒸發器

毛氏抽脂瓶

GC4000A 氣相色譜儀

GC儀器條件：

色譜柱：HP-88  100m×0.25mm×0.20μm    汽化室溫度：250℃ 

柱箱溫度：初時溫度120℃ 三階程升到230℃. FID檢測器溫度：300℃

載氣：高純N₂   分流比：70:1  柱流速：1mL/min   進樣量：1μL 

程升條件：

表1 GC程升條件

1.3樣品處理過程

稱取混合均勻的固體試樣約 1.5 g（精確到 0.1 mg）于毛氏抽脂瓶中，加入10 mL 45 ℃±2 ℃的水，將試樣洗入毛氏抽脂瓶的小球中，充分混合，直到試樣完全散開，冷卻至室溫。

脂肪的提�。合蛎�氏抽脂瓶中加入 3.0 mL 氨水，混勻。置于 60 ℃±2 ℃水浴中 15 min～20 min，冷卻至室溫。加入 10 mL乙醇和1 滴剛果紅溶液，混勻。再加入25mL 乙醚，塞上瓶塞，手動震蕩 1 min。再加入 25mL 石油醚， 震蕩 1 min， 4000 轉/分鐘離心10min，傾出上清液于圓底燒瓶（與旋轉蒸發儀配套）中，為第一次提取。在剩余試樣液中再加入5 mL 乙醇，25 mL 乙醚，25 mL 石油醚按上述操作步驟進行第二次提取。用離心機離心分層后傾出上清液與第一次的上清液合并。將圓底燒瓶置于旋轉蒸發器上，在 60 ℃±2 ℃通入氮氣條件下旋轉蒸發除去溶劑，保留殘渣，即為脂肪。

脂肪酸甲酯的制備：將上述脂肪用正己烷溶解并定容至 10.0 mL，取出 3.0 mL 于 10 mL具塞試管中，加入 0.3 mL 氫氧化鉀-甲醇溶液。蓋緊瓶蓋，渦旋振蕩器上劇烈振搖 2 min，4000 轉/分鐘離心 5 min 后將上清液轉入氣相色譜試樣瓶中，此為試樣測定液。

2         結果與討論

2.1    標準曲線

實驗配制的反式脂肪酸標準工作液的濃度梯度如下：

表2  標準工作液濃度梯度

在上述儀器條件下，根據濃度和峰面積分別繪制兩種反式脂肪酸甲酯的標準曲線，見圖1至圖3，其中圖1為標準液的色譜分離譜圖。實驗獲得反-9-十八碳一烯酸甲酯在0~0.9mg/mL，反-9,12-十八碳二烯酸甲酯在0~0.85mg/mL時濃度和峰面積良好的線性關系，它們分別的相關系數為0.9991和0.9995。

圖1 標準液的色譜分離譜圖

圖2 反-9-十八碳一烯酸甲酯的校準曲線

曲線方程：Y = 35223.966102X +0.0000

相關系數：r = 0.9991

圖3 反-9，12-十八碳二烯酸甲酯的校準曲線

曲線方程：Y = 30457.65138 X +0.0000

相關系數：r = 0.9995

2.2    實際樣品分析結果

按照上述的實驗方法對兩個奶粉樣品分別進行反式脂肪酸的提取及甲酯化，并進行氣相分析。根據奶粉樣品中反-9-十八碳一烯酸甲酯和反-9,12-十八碳二烯酸甲酯的峰面積，按各自的校準曲線，利用外標法進行定量分析，獲得不同樣品提取物中反-9-十八碳一烯酸甲酯和反-9,12-十八碳二烯酸甲酯的濃度。

結果如表3所示。圖4、圖5分別為1#樣品和2# 樣品的色譜分析譜圖。

圖4 1#樣品色譜分析譜圖

圖5 2#樣品色譜分析譜圖

表3 樣品提取物中反式脂肪酸甲酯的質量濃度

上述得到的結果是樣品提取物中反式脂肪酸甲酯的質量濃度，根據這個結果再結合公式1即可計算出樣品中反-9-十八碳一烯酸和反-9,12-十八碳二烯酸的具體含量。再根據公式2計算出樣品中反式脂肪酸的總含量。計算結果如表4所示。

    公式1

式中：

X_（1或2） —— 樣品中反十八碳一烯酸或反十八碳二烯酸含量，單位為 mg/100g；

V —— 樣品的定容體積，單位為 mL；

m —— 樣品質量，單位為 g；

c_i—— 試樣測定液中反十八碳一烯酸甲酯或反十八碳二烯酸甲酯的質量濃度，單位為 mg/mL；

M_ai —— 反十八碳一烯酸（282.46）或反十八碳二烯酸（280.45）的分子量；

M_bi —— 反十八碳一烯酸甲酯（296.49）或反十八碳二烯酸甲酯（294.47）的分子量。

樣品中反式脂肪酸的總含量 X，按下式計算：

                公式2

式中：

X——反式脂肪酸的總含量，單位為 mg/100g ；

X₁——試樣中反十八碳一烯酸的含量，單位為 mg/100g ；

X₂——試樣中反十八碳二烯酸的含量，單位為 mg/100g。

表4 樣品中反式脂肪酸的含量

2.3精密度實驗

在重復性條件下進行兩次獨立測定，根據測定結果，計算精密度。計算結果如表5所示。

表5 精密度實驗結果

3.結論

本文采用氣相色譜石英毛細柱外標法測定奶粉中的反式脂肪酸含量，兩種反式脂肪酸在各自的濃度范圍內都有良好的線性范圍，相關系數r≥0.999，儀器和方法均具有良好的重復性和穩定性。對2種奶粉樣品進行了檢測分析結果所示，兩次獨立實驗得到的結果間的精密度小于10%，完全符合國標要求。