標題高效液相色譜法測定清肝膠囊中龍膽苦苷的實驗研究

　【摘要】目的建立高效液相色譜法測定清肝膠囊中的龍膽苦苷方法以C����18��反相柱為色譜柱，甲醇—水為流動相。檢測波長270nm，用乙酸乙酯和甲醇混合液作提取劑。結果平均回收率為98.38%。r=0.9995,線性關系良好。結論此方法靈敏、準確，適用于龍膽苦苷的測定。��
　　
　　【關鍵詞】高效液相色譜法清肝膠囊龍膽苦苷��
　　
　　龍膽為龍膽科植物，其根及根莖含龍膽苦苷，龍膽苦苷具有清肝解毒、消食健胃的功效。用高效液相色譜法（HPLC）測定復方制劑中的龍膽苦苷，其操作步驟簡便，樣品回收率高，重現性好，結果可靠，現報道如下。
　　
　　1儀器與試藥��
　　
　　1.1儀器��
　　
　　紫外分光光度計（日本島津UV-260）；高效液相色譜儀（Waters510泵，490紫外檢測器，740數據處理儀）；薄層自動涂鋪器（瑞士CAMAG）；薄層層析點樣臺TLC-SP-1（西安市秦西機械廠）；離心機800型（江蘇醫用設備儀器廠）；微量進樣器（上海醫用激光儀器廠）。��
　　
　　1.2試藥��
　　
　　中性氧化鋁（100～200目）（上海五四試劑廠）；硅膠GF254（青島海洋化工廠）；龍膽苦苷對照品（中國藥品生物制品檢定所）；乙酸乙脂、甲醇、氯仿均勻為分析純（上海試劑一廠）。��
　　
　　2含量測定��
　　
　　2.1色譜條件與系統適用性試驗��
　　
　　用十八烷基硅膠為填充劑；甲醇—水（3：7）為流動相；檢測波長為270nm。理論板數按龍膽苦苷峰計算應不低于3000。��
　　
　　2.2內標溶液的制備��
　　
　　精密稱取咖啡因適量，加甲醇制成1ml含0.4mg的溶液，即得。��
　　
　　2.3測定法��
　　
　　精密稱取龍膽苦苷對照品適量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液。精密量取該溶液和內標溶液各5ml，搖勻，取10ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取本品中含龍膽粉量約0﹒5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇10ml，放置12h，時時振搖，精密加內標溶液2ml，加甲醇至刻度，搖勻，取10ul注入液相色譜儀，按內標法以峰面積計算，即得。��
　　
　　3試驗方法與結論��
　　
　　3.1條件試驗��
　　
　　3.1.1龍膽苦苷對照品的含量確定和水溶性實驗��
　　
　　3.1.1.1龍膽苦苷的測定:照高效液相色譜法采用NucleosilC����18��柱（46cm×0.25cm），精密吸取含量測定項下配制的龍膽苦苷對照品溶液進樣，以甲醇—水為流動相，連續重復進樣3次，歸一化法計算含量。
　　
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　　3.1.1.2水溶性實驗：精密稱取龍膽苦苷對照品0.2608g，加水1ml，根據操作規范����［１］��，可見立即溶解。故認為龍膽苦苷對照品水溶性在易溶范圍。
　　
　　[SX（]1[]0.2608[SX）]=38.3ml/g��
　　
　　3.1.2樣品與龍膽苦苷對照品紫外光譜對照取復方制劑樣品和對照溶液2.5ml，分別在波長200～400nm間進行掃描。結果表明：二者紫外吸收曲線基本一致，在波長（271±1）nm處均有最大吸收。
　　
　　3.1.3提取溶劑的選擇：龍膽苦苷為裂環環烯醚萜單糖苷，極性大。清肝膠囊為復方制劑，成分復雜，提取溶劑的選擇會影響下一步的薄層分離。因此，試用了甲醇、丙酮、乙酸乙酯等溶劑提取找出最佳提取溶劑。試驗表明，甲醇對龍膽苦苷的提取效率高，同時出提出大量糖類水溶性雜質，影響薄層分離，干擾紫外吸收。而乙酸乙酯雖提取效率較差，但提取的糖類等雜質也較少。因此，采用乙酸乙酯—甲醇（70：10）的比例混合作提取溶媒；既能定量地提取龍膽苦苷，又能盡可能少地提出雜質，在該溶媒條件下的最大吸收波長為270nm。��
　　
　　3.2回收率試驗��
　　
　　取清肝膠囊樣品5份，精密稱量，分別加入一定量的龍膽苦苷對照品，照含量測定項下的方法分別測定含量，計算回收率。
　　
　　3.3精密度實驗��
　　
　　3.3.1樣品測定精密度實驗取清肝膠囊樣品6份，每份5g，照含量測定項下的方法試驗，分別測定含量。
　　
　　3.3.2薄層層析精密度試驗取清肝膠囊樣品5g，照含量測定項下的方法試驗，在6塊薄層板上點樣����［２］��，每塊板上點2個點，測定含量。��
　　
　　3.4紫外光譜試驗��
　　
　　取清肝膠囊與空白龍膽制劑各5g，分別照含量測定項下的方法制備供試品溶液，照分光光度法試驗，在200～350nm間進行重疊掃描。結果表明，在270nm處，制劑中其它原料幾乎不影響龍膽苦苷的測定。��
　　
　　3.5標準曲線的制備��
　　
　　取龍膽苦苷對照品約400mg，照含量測定項下的方法繪制標準曲線�；貧w方程為Conc=17﹒856A-0.0275，r=0.9995，曲線通過原點，線性相關較好。��
　　
　　4討論��
　　
　　采用高效液相色譜法測定清肝膠囊中的龍膽苦苷的含量，樣品的預處理是關鍵。在工藝上采用連續回流提取方法提取龍膽苦苷����［３］��，至提取液近無色時，可提盡龍膽苦苷。其殘渣經薄層層析檢驗，無龍膽苦苷斑點。提取液濃縮后加入水，龍膽苦苷轉溶于水中，過濾，可除去提取中帶來的脂溶性雜質；水溶液經氧化鋁層析柱，甲醇洗脫，大部分色素等雜質被吸附����［４］��，而龍膽苦苷被洗脫下來。柱層析洗脫過程中，采用100ml甲醇洗脫，龍膽苦苷幾乎全部洗下來。��
　　
　　采用薄層層析方法，用硅膠GF254板分離，熒光熄滅法定位，龍膽苦苷斑點清晰，有利于刮板。��
　　
　　通過試驗證實，采用高效液相色譜法測定清肝膠囊中的龍膽苦苷，方法準確、穩定、可靠。��