標題頂空氣相色譜法殺菌劑殘留分析

　10.1 有機硫殺菌劑
　　有機硫殺菌劑是指毒性基團或成型基中含有硫的有機合成殺菌劑，是最早研制的有機殺菌劑。有機硫殺菌劑具有高效、低毒、殺菌譜廣、藥害少、不易產生抗藥性等優點。
　　按照已知的化學結構該類殺菌劑主要分為三種類型：
　　1. 二硫代氨基甲酸鹽類衍生物：是最重要的一類有機硫殺菌劑，包括乙撐二硫代氨基甲酸鹽類和二甲基二硫代氨基甲酸鹽類，前者即代森類，主要有鋅鹽、錳鹽和銨鹽等，代表品種是代森錳鋅等；后者即福美類，如福美鐵、福美鋅等；還有非鹽的二分子二甲基二硫代氨基甲酸氧化物，如福美雙等。
　　2. 三氯甲硫基類：含有三氯甲硫基的多種衍生物，如酰胺、酰羥銨、酰肼、醇類、酚類、硫醇類、硫酚類、磺酰胺類、硫代磺酸類、雜環類等。其中酰胺類最重要，主要的品種有克菌丹和滅菌丹。
　　3. 氨基磺酸鹽和取代苯磺酸類，如氨基磺酸鈉、敵銹鈉等。
　　10.1.1 乙撐二硫代氨基甲酸鹽類殺菌劑
　　乙撐二硫代氨基甲酸鹽類（Ethylenebisdithiocarbomates, EBDCs），即代森類殺菌劑，是一類廣泛使用的保護性殺菌劑，其主要品種有代森錳（maneb）、代森鋅（zineb）、代森錳鋅（mancozeb）、代森鈉（nanbam）、代森銨（amobam）、代森環（milneb）等。最常用的品種為代森錳鋅。
　　該類殺菌劑主要用于防治果樹、蔬菜、西瓜等作物的葉斑病、葉霉病、霜霉病、炭疽病等。從殘留角度，人們關心其在蔬菜、水果及其在土壤環境中的殘留。由于該類藥劑幾乎沒有內吸作用，使用后主要殘留在植物體表面，因此，殘留提取比較容易。
　　該類殺菌劑的雜質及其在環境中的降解產物乙撐硫脲（ethylenethiourea, ETU），引起試驗動物甲狀腺瘤，具有致癌性、致突變性和致畸性，因此乙撐二硫代氨基甲酸鹽類殺菌劑的安全問題受到高度重視。
　　1．頂空氣相色譜法
　　目前代森類殺菌劑的殘留量以CS2來表示。因此，此類殺菌劑的殘留測定的是CS2的含量。一般采用頂空氣相色譜法進行測定。
　　⑴. 測定原理
　　在密閉容器內代森類殺菌劑與反應分解生成二硫化碳并全部汽化進入反應瓶上部空間的氣相之中，通過測定反應瓶中液－氣平衡狀態下，氣相中二硫化碳的量來確定代森類農藥的殘留量。
　　⑵. 樣品處理
　　稱取一定量（50g）經過粉碎的蔬菜、水果、土壤、糧食樣品或量取一定體積的水樣于反應瓶中，反應瓶可用250mL的醫用葡萄糖注射液瓶代替（密封要好）。加入一定量（3g）的氯化亞錫（還原劑）和一定量的10％的鹽酸溶液，立即加塞密封。將反應瓶于70℃恒溫水浴中反應2h（反應中要經常檢查氣密性），取出反應瓶置40℃水浴中恒溫待測。用注射器吸取反應瓶上部空間氣體，進行氣相色譜測定。
　　二硫化碳標準曲線的制定：每次開機氣相色譜測定時均需要制作標準曲線，并達到線性回歸要求才能使用。于反應瓶中加入與樣品數量相同體積或重量的蒸餾水，及一定數量的二硫化碳標準溶液，其余步驟同樣品測定。
　　⑶. 氣相色譜測定
　　色譜條件一：SP7800型氣相色譜儀 ECD檢測器，1.8m×3mm玻璃柱，20% OV–101/Gas Chrom Q 100～120目。色譜柱溫度50℃、檢測器200℃，進樣口100℃。氮氣（>99.999%）11.6mL/min，tR：1min45s（CS2）。最小檢測量：2×10-11g。
　　色譜條件二：SP7800型氣相色譜儀 NPD檢測器，2m×3mm玻璃柱，2%QF-1+1.5% OV-17/Gas Chrom Q 80～100目。色譜柱溫度80℃、檢測器145℃，進樣口120℃。氮氣（>99.999%）20mL/min，空氣15mL/min，氫氣 10mL/min 。tR：29s（CS2）。最小檢測量：1.125×10-10g。
　　色譜條件三：SP7800型氣相色譜儀 FPD檢測器，2m×3mm不銹鋼柱，5%SE-30／101白色酸洗擔體，177～149μm （80～100目）。色譜柱溫度65℃、檢測器150℃，進樣口120℃。氮氣（>99.999%）25mL/min，氫氣85mL/min，空氣90mL/min。tR：1min（CS2）。最小檢測量：5×10-10g。
　　色譜條件四：SP7800型氣相色譜儀 FPD檢測器，2.1m×3mm不銹鋼柱，5%SE-30/GCS 880 AW DMCS,80～100目。色譜柱溫度65℃、檢測器150℃，進樣口150℃。氮氣（>99.999%）25mL/min，氫氣88.3kPa，空氣127.5kPa。tR：0.95min（CS2）。最小檢測量：2×10-10g。
　　色譜條件五：GC- FPD-S，2m×3mm不銹鋼柱，15%OV-101/Gas Chromsorb W AW DMCS（80～100目）。色譜柱溫度60℃、檢測器150℃，進樣口120℃。氮氣（>99.99%）15mL/min，氫氣160mL/min，空氣140mL/min及70 mL/min。tR：1min（CS2）。最小檢測量：1.8×10-10g。
　　2．乙撐硫脲殘留測定方法
　　乙撐硫脲（ETU）的殘留分析方法有許多，主要有GC、HPLC、TLC測定，其中以GC測定為主。由于乙撐硫脲（ETU）的極性非常強，蒸氣壓極低，難以用氣相色譜法直接進行測定，主要是由于色譜峰嚴重拖尾和檢測靈敏度達不到殘留分析的要求。目前主要采用衍生后氣相色譜測定或用高效液相色譜法，一般HPLC的靈敏度往往不如GC高，所以采用衍生后GC測定的比較多。
　　氣相色譜法
　　⑴．乙撐硫脲的衍生方法
　　乙撐硫脲的氣相色譜測定需要進行衍生化，衍生方法主要有以下幾種：
　　①. 采用芐氯（benzyl chloride）和三氟乙酸酐（thifuoroacetic anhydride）進行衍生。
　　首先使ETU與芐氯回流反應，反應液經提取和重結晶得熔點為60~70℃的S-芐基ETU（S-benzyl ETU），以S-芐基ETU做為標準物質進行定性和定量。在分析殘留樣品時，用甲醇提取ETU。使提取液與芐氯回流反應為S-芐基ETU，并凈化和濃縮，然后使S-芐基ETU與三氯氟乙酸酐反應，反應物以GC-ECD測定，衍生過程見圖10-1所示。
　　圖10-1 芐氯衍生ETU反應
　　此方法將F原子引入，在ECD檢測時靈敏度較高。用該方法測定蘋果中ETU殘留，添加濃度為0.0103~1.03mg/kg 時，ETU的平均回收率為94.7±5.9%，樣品的最小檢測濃度達到0.005mg/kg。
　　②. 采用1-溴丁烷對ETU進行衍生。
　　在衍生時加入二甲基酰胺（dimethyformamide，DMF）和氫硼化鈉（sodium borohydride）以促進衍生反應的進行。衍生后得S-丁基ETU，用GC-FPD-S進行測定。衍生反應式見圖10-2。
　　圖10-2  1-溴丁烷衍生ETU反應
　　用此方法對蘋果、香蕉、馬鈴薯和西紅柿中的殘留量進行測定，添加0.01~1.0 mg/kg ETU的回收率為61±13%~85±1%，樣品中ETU最小檢出濃度小于0.01 mg/kg。
　　③. 采用芐氯（benzyl chloride）和五氟苯酰氯（pentalfluorobezoyl chloride）衍生。
　　有人認為在第一種衍生方法中，存在回收率不穩定，而且對照樣品中有干擾峰出現。所以提出用五氟苯酰氯（pentalfluorobezoyl chloride）代替第一種方法中的三氟乙酸酐。該方法的反應過程見圖10-3所示。
　　圖10-3  S-芐基ETU五氟苯�；�反應
　　用此方法對大豆、蘋果、菠菜中的ETU殘留分析進行了研究，添加0.01~1.28mg/kg ETU的回收率為93%~114%，樣品最小檢出濃度為0.005 mg/kg。
　　④. 用間-三氟甲基芐氯與ETU反應得S-間-三氟甲基芐基ETU（產物Ⅰ），產物（Ⅰ）可進一步與三氟乙酸酐反應得產物（Ⅱ），兩種產物均可用GLC-ECD進行測定，反應過程見圖10-4所示。
　　圖10-4  間-三氟甲基芐氯與ETU衍生反應示意圖
　　產物（Ⅱ）比產物（Ⅰ）的靈敏度有所提高。此方法對大豆、蘋果、馬鈴薯和西紅柿中添加0.01~1.0 mg/kg ETU的回收率為92.5±4.6%，最小檢出濃度為0.002 mg/kg。
　　目前，在眾多衍生方法中以用芐氯或芐溴衍生的最多，從化學結構上看芐溴更容易與ETU進行衍生。
　　⑵. 乙撐硫脲的殘留分析：衍生氣相色譜法
　　國內分析乙撐硫脲殘留的常用衍生氣相色譜法有以下幾種：
　　方法一：
　　該方法采用溴化芐衍生后GLC－FPD-S測定，方法原理如下：
　　①. 硫芐基乙撐硫脲（S-ETU）的制備：取0.5gETU，加入溴化芐1.0mL，加入無水乙醇，回流反應30min，用50mL 二氯甲烷轉入分液漏斗，加入1M的鹽酸20mL及50mL水，振蕩分層，棄去下層。上層加入20mL10％的NaOH溶液，振蕩后加入50mL苯，充分振蕩后靜置分層，棄去下層。上層轉入另外分液漏斗中，用50mL苯再提取1次；上層經無水硫酸鈉脫水后注入燒瓶中，濃縮結晶。此結晶再重結晶2次得熔點為68～69℃的S-ETU結晶。
　　②. 樣品處理：取50g樣品，于碘量瓶中，加入50mL水及100mL無水乙醇，振蕩提取30min，減壓過濾，準確量取100.0mL濾液于250mL燒瓶中，加入濃度為10-4g/mL的溴化芐溶液2mL，回流反應30min，冷卻后用100mL水轉入分液漏斗中，加入1M HCI 5mL，振蕩后加入50mL二氯甲烷，充分振蕩后靜置分層，棄去下層，上層再用二氯甲烷提取1次，方法同上。加入10％的NaOH 5mL于上層溶液中，振蕩后分別用50mL二氯甲烷提取3次，二氯甲烷經過無水硫酸鈉脫水后注入燒瓶，濃縮后GC-FPD-S測定。
　　③. 氣相色譜測定：SP7800型氣相色譜儀 FPD檢測器，2m×3mm玻璃柱，7% OV-17/Gas Chrom Q 80～100目。檢測溫度，柱溫230℃，檢測器230℃，進樣口250℃。載氣：氮氣 160 mL/min，空氣150 mL/min及70 mL/min，氫氣160mL/min。保留時間：1 min55s。
　　此方法的最小檢出量：1.25×10-10g，添加0.05、0.1和1.0 mg/kg 3個濃度ETU的回收率在96.86±5.71%～98.68±3.26％。
　　方法二：
　　①. 樣品處理：稱取50g植物樣品（蔬菜或水果，經搗碎）、土壤（粉碎）樣品，置于250mL三角瓶中，加50mL水，100mL乙醇，振蕩30min，減壓抽濾。取100mL濾液置250mL燒瓶中，加2mL 1.443×10-4g/mL 溴化芐乙醇溶液，回流反應30min。冷卻后用100mL水轉入分液漏斗中，加5mL1mol/L鹽酸，振蕩后用2×50mL二氯甲烷提取，收集二氯甲烷提取液。再加入5mL 10% 氫氧化鈉溶液于上層中，振蕩后用3×50mL二氯甲烷萃取，合并提取液經無水硫酸鈉脫水，濃縮，定容后待測。
　　②. 氣相色譜法測定：SP7800型氣相色譜儀NPD檢測器，2m×3mm玻璃柱，2%QF-1+1.5% OV-17/Gas Chrom Q 80～100目。檢測溫度  柱溫245℃，檢測器245℃，進樣口260℃。載氣：氮氣 20 mL/min，空氣15 mL/min，氫氣8mL/min。保留時間：1 min24s。
　　該方法測定香蕉和土壤中乙撐硫脲，添加0.05～1mg/kg，回收率為89.2%～98.2%，最小檢出量：6.82×10-10g，最小檢出濃度：0.014mg/kg。
　　高效液相色譜法
　　方法一 ：
　　①. 樣品處理：
　　番茄提�。喝�50.0g番茄樣本于組織搗碎機內,加75mL水,搗碎后迅速用氨水調整勻漿液pH11～12，同時加入5g氯化鈉、5g Celite545和100mL乙醇，再混合勻漿2min以上，用布氏漏斗過濾，甲醇少量分多次沖洗樣品缸和布氏漏斗，必要時調整過濾液pH7～9，定容250mL。取定容溶液25mL于100mL蒸發瓶中加入2滴1%癸醇丙酮溶液，在30℃條件，減壓濃縮至約8mL，取下往蒸發瓶中加入10g 102白色酸洗擔體，迅速劇烈的震蕩，直到全部團塊散開。向蒸發瓶內加75mL淋洗液乙醇/三氯甲烷（4/96, v/v），搖勻。
　　土壤提�。悍Q取50.0g土壤樣品于碘量瓶內，所加溶液同番茄，在電動振蕩機上振蕩提取2h，其余步驟同番茄。
　　柱層析凈化：將擔體懸浮液倒入氧化鋁層析柱中，層析柱內裝5g已活化的氧化鋁，柱下500mL蒸發瓶內裝10mL水和6滴25%癸醇丙酮溶液。待75mL淋洗液的液面接近102白色擔體時，再用200mL淋洗液分4次沖洗蒸發瓶和層析柱。待淋洗液自然滴干后按上述減壓蒸餾條件濃縮淋出液約2～3mL，停止濃縮加水定容5mL，待測。
　　②. 高效液相色譜法測定：LC2100型液相色譜儀，紫外檢測器（UV，波長233nm）。色譜柱：25cm×4.6mm）不銹鋼柱，內裝Spherisorb 5μ-C18。流動相：甲醇／水 （95/5,V/V）。柱溫：40℃。流速：0.5mL/min。保留時間：約8min。該方法最小檢出量：1×10-9g，番茄和土壤中添加乙撐硫脲0.04～0.10mg/kg，回收率為88.9%～89.2% ，土壤中添加0.05～0.10mg/kg ，回收率為85.0%～91.3%。
　　方法二：
　　①. 樣品處理：
　　提�。悍Q取20g樣品置于250mL具塞三角瓶中，加入80mL甲醇，振蕩提取30min。提取液用布氏漏斗經玻纖濾膜抽濾，并用30mL甲醇分多次洗滌三角瓶及濾渣，合并濾液。將合并后的提取液倒入250mL分液漏斗中，用80mL，60mL，60mL石油醚振搖洗滌三次，每次1min，靜置分層后，棄去石油醚相。將甲醇提取液在旋轉蒸發器上（≤40℃）濃縮至約10mL。
　　液-液分配凈化：將上述濃縮提取液轉移至250mL分液漏斗中，用15mL水分數次清洗濃縮瓶，并轉移至分液漏斗中。加入20gKF·2H2O和0.6g氯化銨，振搖使完全溶解。用100mL×2二氯甲烷/甲醇（9:1,V/V）提取兩次，每次1min，合并萃取液并經無水硫酸鈉過濾入250mL圓底燒瓶中，在旋轉蒸發器上（≤40℃）濃縮至1～2mL。土壤樣品可省去提取步驟，只將石油醚洗滌后的提取液經濃縮至干，并用少量淋洗液溶解后直接進行柱凈化。
　　柱層析凈化：在30cm（長）×1.8cm（內徑）玻璃層析柱中，依次裝入4cm厚無水硫酸鈉，4g弗羅里硅土，4g混合凈化劑及3～4cm厚無水硫酸鈉，在混合凈化劑與下層的弗羅里硅土和上層的無水硫酸鈉之間可用少量脫脂棉分隔開。用25mL淋洗液預淋凈化柱，然后將上述濃縮液轉移到柱中，用少量淋洗液多次洗滌圓底燒瓶并轉入柱中，再用淋洗液淋洗，棄去前10mL，收集后50mL淋出液。將所收集的淋出液轉移到100mL圓底燒瓶中，并用旋轉蒸發（≤40℃）濃縮至干，用流動相甲醇/水（30:70,V/V）定容至4mL，并用Millipore專用濾膜濾器過濾后待測定。
　　②. 高效液相色譜測定：LC2100型液相色譜儀，色譜柱：Kromsil 25cm×4.6mm C18柱；溫度：室溫；流動相：甲醇／水（30:70,V/V）；流速：0.4mL/min。波長：254nm，保留時間：7.5min。該方法最低檢出濃度：0.02mg/kg；回收率：添加乙撐硫脲0.05～10.00mg/kg的回收率在83.2%～90.7%。
　　10.1.2 二甲基二硫代氨基甲酸鹽類殺菌劑
　　該類殺菌劑重要的品種有銨鹽、鋅鹽、鐵鹽等，目前在我國使用的主要是砷鹽中的福美砷和氧化物福美雙（thiram）。以福美雙為例介紹其在土壤及植物體內的殘留分析方法。
　　1. 方法原理
　　樣本用丙酮－甲醇混合液提取，二氯甲烷液－液分配，弗羅里硅土－活性炭柱層析凈化，高效液相色譜法（UV）測定的殘留測定方法。
　　2. 樣品處理
　　⑴. 提取
　　土壤：稱取10g樣品，加50mL丙酮/甲醇（1:1,V/V），振蕩提取2h，然后用裝有無水硫酸鈉的漏斗過濾，濾渣用150mL 丙酮／甲醇（1:1,V/V） 溶液沖洗三次，置于旋轉蒸發器上濃縮濾液到一定體積，加入已配好的內標物萘，萘的體積是濾液濃縮體積的1/2，最后用甲醇／丙酮（10:1,V/V）定容，待測。
　　小麥籽粒：稱取5g樣品，加50mL丙酮／甲醇（1:1,V/V），振蕩提取2h，用30g無水硫酸鈉的漏斗過濾，濾渣用150mL丙酮／甲醇（1:1,V/V）溶液沖洗三次，用旋轉蒸發器濃縮到約2mL。
　　鮮植株：稱取25g鮮植株，切碎，加75mL丙酮，振蕩提取2h，用波氏漏斗過濾，殘渣用50mL二氯甲烷分三次洗滌，濾液轉移到分液漏斗中，加30mL 3%氯化鈉水溶液，用3×50mL二氯甲烷萃取，合并萃取液，濃縮至約2mL。
　　⑵. 柱層析凈化
　　籽粒：層析柱中依次裝入2cm厚無水硫酸鈉，6g弗羅里硅土（80～100目，用前130℃烘5h，冷卻后加5%水減活），1g活性炭（顆�；钚蕴�，層析用，鹽酸洗，煮沸1h，冷卻后洗至中性），2cm厚無水硫酸鈉，將濃縮物轉移到層析柱中，用150mL丙酮/甲醇（1:1,V/V）混合液淋洗并收集淋出液，然后濃縮到一定體積，按提取方法中的加萘方法加入一定量的萘，用甲醇/丙酮（10:1,V/V）溶液定容，待測。
　　植株：層析柱中依次裝入2cm厚無水硫酸鈉，6g弗羅里硅土，2g活性炭，1g助濾劑，2cm厚無水硫酸鈉，用150mL二氯甲烷淋洗并收集淋出液，濃縮到一定體積，按前面方法計算加入萘的量，加入萘，用甲醇/丙酮（10:1,V/V）溶液定容，待測。
　　3. 高效液相色譜測定
　　檢測器：uv2100紫外檢測器（UV，波長254nm）；色譜柱：20rbax ODS柱，0.25m（長）×4.6mm（內徑）不銹鋼柱；流動相：用等級梯度流動相，50/50（甲醇／水）2min，55/45（甲醇／水）3 min，60/40、2 min，65/35、1 min，70/30、5 min，50/50、2 min；柱溫：45℃；保留時間：7 min12s。該方法的最小檢出量：4.9×10-10g；最低檢出濃度：0.025mg/kg；回收率：添加0.5～2.5 mg/kg的回收率植株為75.5%～93.0%；添加2.5 mg/kg，土壤回收率為88.3% ，籽粒為97.4%；變異系數：植株為6.5%～8.5% ，土壤為11.8% ，籽粒為11.4% 。
　　10.1.3 三氯甲硫基類殺菌劑
　　以該類殺菌劑的主要品種克菌丹（captan）為例，介紹其殘留分析方法。
　　1. 樣品處理
　　⑴. 提取
　　水果、蔬菜類：樣品置于組織搗碎機中高速搗碎后，稱取該樣品20.0g于250mL具塞三角燒瓶中，加入100mL石油醚/丙酮（4/1, V/V），振蕩30min。用布氏漏斗抽濾，以每次20mL的石油醚洗滌殘渣，洗滌2次，濾液合并于500mL分液漏斗中。再以每次50mL 4%的硫酸鈉水溶液洗滌，洗滌2次，以除去丙酮。上層石油醚經無水硫酸鈉柱脫水收集于250mL燒瓶中，用10mL石油醚洗滌分液漏斗及無水硫酸鈉柱,在旋轉蒸發器上濃縮至約5mL。
　　油脂類：準確稱取3.0g油樣，于100mL燒杯中，加入20 mL正己烷溶解油樣，將油樣移至250 mL分液漏斗中，再用15 mL正己烷分數次洗滌燒杯并轉至分液漏斗中，加35 mL經正己烷飽和的乙腈，振蕩1min，靜置分層。將下層液放置于另一500 mL分液漏斗中，加入100 mL 4%的硫酸鈉水溶液和100 mL正己烷，再將250 mL分液漏斗中的正己烷層用乙腈（經正己烷飽和）提取3次，每次用乙腈25 mL，將乙腈提取液合并至500 mL分液漏斗中，輕輕振搖1 min，農藥則轉移至正己烷中，靜置分層,棄去水相。分別用50 mL4%的硫酸鈉水溶液洗滌正己烷層兩次,棄去水相，正己烷層經無水硫酸鈉柱脫水收集于250 mL燒瓶中，用10 mL正己烷洗滌分液漏斗及無水硫酸鈉柱,在旋轉蒸發器上濃縮至約5 mL。
　　⑵. 凈化
　　在2cm×25cm玻璃層析柱中的底部加少許玻璃棉，再依次加入1cm高無水硫酸鈉，5g弗羅里硅土（60～80目，650℃灼燒6h，冷卻后貯于密閉容器內備用，使用前于130℃下活化5h）和1cm高無水硫酸鈉。先以40 mL無水乙醚/石油醚（15/85, v/v）（對油脂樣品，用無水乙醚/正己烷，15/85, v/v,下同）預洗層析柱，棄掉淋出液。把濃縮的樣品液移入柱內，以每次5 mL的石油醚或正己烷洗樣液濃縮瓶，洗滌2次，一并移入層析柱，最后以200 mL上述無水乙醚-石油醚或無水乙醚-正己烷洗脫，收集全部洗脫液，于40℃水浴上減壓蒸至約40 mL，以石油醚或正己烷定容至50 mL，供色譜分析。
　　2. 氣相色譜測定
　　色譜柱：OV-101，30m×0.53mm×1.0μｍ彈性石英毛細管柱；載氣：高純氮氣，線速度：100℃時42cm/s；柱前壓：75kPa，恒壓方式；尾吹N2：60 mL/min；進樣溫度：250℃，檢測器溫度：300℃；采用不分流進樣方式，進樣量1?L，進樣0.75min后吹掃。柱溫升溫程序：100℃下恒溫4min，然后以8℃/min的速率程序升溫至240℃，繼續恒溫至樣品全部流出（約20min）。該方法在油脂及果蔬中添加50、100、150?g/kg的回收率為84.6％～97.6％，取樣20.0g，定容5mL，進樣1?L的最小檢出濃度為10.0?g/kg。
　　10.2  有機磷殺菌劑
　　10.2.1 概述
　　有機磷類殺菌劑具有藥效高、用途廣、易分解和低殘留的特點，其作為殺菌劑使用始于二十世紀六十年代，具有很好的內吸性。有機磷殺菌劑主要有三類：
　　1. 硫代磷酸酯類，又包括兩類硫趕型磷酸酯和硫逐型磷酸酯。稻瘟凈（EBP）、異稻瘟凈（IBP）和敵瘟磷（edifenphos）是常見的硫趕型磷酸酯類殺菌劑。硫逐型磷酸酯的代表品種是甲基立枯磷（tolclofos-methyl）。
　　2. 磷酰胺類有機磷殺菌劑，常用的品種是三唑磷胺。
　　3. 金屬有機磷化合物，目前這類有機磷殺菌劑只有三乙磷酸鋁（phosethyl-AI）。
　　本節以敵瘟磷為例，介紹其殘留分析方法。
　　10.2.2 敵瘟磷的殘留分析
　　1. 方法原理
　　該方法中樣品用丙酮提取，二氯甲烷液――液分配，弗羅里硅土柱層析凈化，氣相色譜法（FPD）測定。
　　2. 樣品處理
　　⑴. 提取
　　糧食：稱20g稻米粉，（10g稻殼、植株）放入250mL三角瓶中，加20mL水，80mL丙酮浸泡過夜，振蕩提取2h，用快速濾紙過濾，濾渣用130mL丙酮分多次淋洗，合并丙酮提取液，在60℃水浴中減壓蒸去丙酮。
　　土壤：稱60g土壤，加水30mL，丙酮100mL，振蕩提取2h，用布氏漏斗加10g Celite545助濾劑抽濾，濾渣再用60mL丙酮浸提并振蕩1h，合并兩次濾液，在60℃水浴中減壓蒸去丙酮。
　　水：量取50mL水，放入250mL分液漏斗中，加15mL氯化鈉，用3×25mL二氯甲烷提取。合并二氯甲烷液，在50℃水浴中減壓濃縮至1～2mL。
　　⑵. 凈化
　　液-液分配：將上述的提取濃縮物，轉入250mL分液漏斗中，加4g氯化鈉，25mL飽和氯化鈉水溶液用3×25mL二氯甲烷提取。合并二氯甲烷液，在50℃水浴中減壓濃縮至1～2mL。
　　柱層析：層析柱中依次裝入2cm厚無水硫酸鈉，15g弗羅里硅土（60～80目，140℃烘8h用前用5%水脫活），2cm厚無水硫酸鈉。用正己烷濕法裝柱。然后將上述濃縮液用氣流吹干，再用少量正己烷把殘留物轉到層析柱中。用乙醚／正己烷（6:4,V/V）混合液淋洗，棄去前15mL淋出液，收集后95mL淋出液，在50℃水浴中減壓濃縮至1～2mL后，再用N2流吹干，用正己烷定容后待測。
　　3. 氣相色譜測定
　　檢測器：火焰光度檢測器（FPD-P）；色譜柱：150cm（長）×3.2mm（內徑）玻璃柱；擔體：Chromsorb W HP,80～100目；固定液：10%OV-3；檢測溫度：色譜柱260℃，檢測器280℃，進樣口280℃；載氣：氮氣（≥99.99%），80mL/min；燃燒氣：氫氣72mL/min，空氣52mL/min。保留時間1min。該方法的最小檢出量：2.4×10-10g；最低檢出濃度：糧食為0.02mg·kg-1，稻殼及植株為0.04 mg·kg-1，土壤為0.01 mg·kg-1 ,水為0.05 mg·L-1；回收率：添加0.1~0.5 mg·kg-1，糧食回收率為86.3%，植株81.3%，稻殼89.4%，土壤94.2%，田水91.0%。變異系數：稻米為8.0%，稻殼、植株為4.9%、6.0%。土壤及田水為10.2%和3.0%。
　　10.3 取代苯類殺菌劑
　　10.3.1 概述
　　取代苯類化合物的結構特征是以苯核為母體，品種較復雜，沒有明顯的系統性。重要品種如：百菌清（Chlorothalonil）、五氯硝基苯（PCNB）等。
　　在殘留分析中，該類殺菌劑結構中多含有Cl原子，因此測定時可以考慮用GC－ECD進行。本節主要以百菌清為代表介紹其殘留分析方法。
　　10.3.2 蔬菜、水果中百菌清的殘留分析
　　1. 方法原理及適用范圍
　　樣品中的百菌清經提取、凈化后用具有電子捕獲檢測器的氣相色譜儀測定，與標準比較定量。百菌清含有電負性較強的氯原子，選用電子捕獲檢測器定量測定。折算出百菌清的含量。本方法適用于百菌清在蔬菜和水果中的殘留分析。
　　2. 樣品處理
　　⑴. 提�。�
　　稱取25g黃瓜勻漿，置于250mL錐形瓶中，加60mL丙酮及50％磷酸2mL，充分振搖2min，過濾，用20mL丙酮洗滌錐形瓶2次，濾液全部移入250mL分液漏斗中，并加入2％硫酸鈉溶液100mL，搖勻后用環己烷60mL提取三次，靜置分層后，提取液經無水硫酸鈉漏斗干燥，減壓濃縮至5mL待凈化。
　　⑵. 凈化
　　將層析柱底部墊少許脫脂棉，依次裝入2cm無水硫酸鈉，7g弗羅里硅土，2cm無水硫酸鈉，敲實并成一平面。然后用15mL環己烷預淋層析柱，棄去預淋液。將濃縮的樣品提取液倒入柱中，用100mL環己烷－丁酮（20:1）混合液分4次淋洗，收集全部淋洗液，濃縮后定容，進行氣相色譜分析。
　　3. 氣相色譜測定
　　長1.5m、內徑3mm的玻璃柱。填裝涂有1.5％OV-210的Chromosorb W HP（80～100目）；柱箱194℃，檢測器255℃，汽化室260℃；高純氮流速30mL/min。保留時間為3min41s。該方法的最小檢出量為1.2×10-12g，最小檢出濃度為0.048mg/kg，黃瓜添加0.1、1.0、5.0 mg/kg的回收率為80.8％～86.3％。
　　10.3.3 百菌清及4-羥基百菌清的殘留分析
　　1. 方法原理
　　樣品用酸性丙酮提取，乙醚提取，弗羅里硅土柱層析凈化，氣相色譜法測定百菌清。與3-甲基-1-p-甲苯三氮烯甲基化反應，酸性氧化鋁柱層析凈化后，氣相色譜法測定4-羥基百菌清。
　　2. 樣品處理
　　⑴. 提取
　　稱取50g番茄勻漿液或土壤，放入300mL具塞三角瓶中，加入150mL酸化丙酮（丙酮／硫酸／水，51:1:1，V/V/V），置于振蕩器上振蕩2h，放置過夜，用布氏漏斗抽濾，用20mL丙酮洗滌瓶和殘渣3次，合并濾液和洗液，減壓濃縮丙酮殘余物用0.4mol/L硫酸氫鈉水溶液和稀硫酸調至pH4.5。定量轉移到500mL分液漏斗中，加入3×50mL石油醚劇烈振蕩以提取百菌清。水相轉移至另一分液漏斗中，石油醚相在旋轉蒸發器上濃縮近2mL，再用空氣吹至微干。殘留物用淋洗液A（石油醚/二氯甲烷，4:1，V/V）溶解，并定容至25mL。
　　水相中加入15mL硫酸（濃硫酸／水，1:1,V:V），調節pH至＜2，用3×50mL石油醚／乙醚（1:1，V/V）混合醚提取4－羥基百菌清，濃縮提取液至微干，加10mL甲醇／鹽酸（3:1，V/V），再加入5mL3-甲基-1-p-甲苯三氮烯的乙醚液（0.1g 3-甲基-1-p-甲苯三氮烯溶于5mL乙醚中），放置30min，吹盡乙醚，殘留物用5mL二氯甲烷溶解。
　　⑵. 凈化
　　百菌清：層析柱底塞入脫脂棉，然后依次裝入1.5cm厚無水硫酸鈉，2g弗羅里硅土，1.5cm厚無水硫酸鈉。用10mL石油醚預淋，棄去淋出液。用移液管準確吸取1mL樣品提取液（相當于2g樣品）于層析柱中，先用30mL洗液A淋洗，棄去淋出液，再用30mL淋洗液B（正己烷/二氯甲烷/乙腈，9.7:10:0.3，V/V/V）淋洗，并收集在50mL磨口三角瓶中，減壓濃縮至微干，甲苯定容，待測。
　　4-羥基百菌清：層析柱下部塞入脫脂棉少許，然后依次裝入1.5cm厚無水硫酸鈉，4g酸性氧化鋁，1.5cm厚無水硫酸鈉。用10mL二氯甲烷預淋，棄去淋出液，將5mL含有樣品的二氯甲烷溶解物轉移到柱中，瓶子用5mL二氯甲烷洗二次，洗液也移至柱中，然后再用30mL二氯甲烷淋洗，收集淋出液，濃縮至微干，用甲苯定容，待測。
　　3. 氣相色譜測定
　　sp7800氣相色譜儀，電子捕獲檢測器（ECD，Ni63）；色譜柱：2m×3mm玻璃柱；擔體：Chromosorb W AM DMCS，80~100目；固定液：1.6％OV-17+6.4％OV-210；檢測溫度：色譜柱200℃，檢測器250℃，進樣口225℃；載氣：高純氮氣60mL/min；保留時間：百菌清為7min，4-羥基百菌清為8min24s。該方法的最小檢出量：百菌清為1.2×10-11g，4-羥基百菌清為2.5×10-11g；最低檢出濃度：百菌清為0.002mg/kg，4-羥基百菌清為0.005mg/kg。添加百菌清0.05~5.0 mg/kg，番茄回收率為85.0~95.9％，土壤為75.3~90.4％。添加4-羥基百菌清0.0025mg/kg，番茄回收率為87.6~92.4％。
　　10.4  雜環類殺菌劑
　　10.4.1 概述
　　雜環類殺菌劑類型較多，發展快，其重要的品種類型有：
　　1. 酰苯胺類衍生物：該類殺菌劑的結構中含有一個酰苯胺基。又分為兩小類，一類是N－取代二甲亞胺類，二類是N－�；�－α－氨基酸類。該類殺菌劑包括紋枯利（菌核凈，Dimerhachlone）、菌核利（Dichlozoline）、乙烯菌核利（Vinclozolin）甲霜靈（metalaxyl）、異菌脲（Iprodione）等常見品種。
　　2. 丁烯酰胺衍生物：其分子結構中含有丁烯酰胺的基本骨架，多為內吸殺菌劑。最代表品種是萎銹靈（Oxathiin）和氧化萎銹靈（Oxycarboxin）。
　　3. 三氯乙基酰胺衍生物：品種較少，主要有嗪胺靈（Triforine）和苯胺靈（Chleraniformethane）。
　　4. 吡啶衍生物：分子中含有吡啶環，代表品種有：吡氯靈（Pyroxychlor）。
　　5. 嘧啶衍生物：結構中含有嘧啶環，主要品種有甲菌定（Dimethirol）和乙菌定（Ethirimate）和磺菌定（Bupirimate）。
　　6. 嗎啉衍生物：分子結構中含有嗎啉環。代表品種有：十三嗎啉（Tridemorph）、嗎菌靈（Dodemorph）和丙菌靈（Fenpropimorph）等。
　　7. 苯并咪唑衍生物：結構中含有苯并咪唑母核。常見品種有：多菌靈（Carbendazim）、苯菌靈（Benomyl）、甲基托布津（Thiophanate-methy）等。
　　8. 三唑衍生物：分子結構中含有一個N－取代的三氮唑母核。代表品種有：三唑酮（Triadimefon）、多效唑（Paclobutrazol）、丙環唑propiconazole等。
　　9. 異噁唑及異噻唑衍生物：品種較少，主要有立枯靈（Hymexazol）等。
　　在以上類型中吡啶類、嘧啶類、咪唑類、哌嗪類、三唑類和嗎啉類等六大類又常稱為甾醇生物合成抑制劑類。甾醇是真菌細胞膜的重要組成部分，影響甾醇生物合成的殺菌劑會使菌體細胞膜的功能受到破壞，最終導致細胞死亡。在二十世紀八十年代，甾醇生物合成抑制劑成為內吸性殺菌劑的開拓性的新領域。甾醇生物合成抑制劑具有強的向頂性傳導活性和明顯的熏蒸作用，殺菌譜廣、高效、低用量、藥效期長等優點，所以已經成為殺菌劑的主要品種類型。
　　10.4.2 甲霜靈的殘留分析
　　該藥劑屬于酰苯胺類衍生物中的N-�；�-α-氨基酸類，其殘留分析主要有氣相色譜和高效液相色譜兩種測定方法。
　　1. 氣相色譜方法
　　⑴. 方法原理
　　樣品用甲醇振蕩提取，二氯甲烷液－液分配，酸性氧化鋁柱層析凈化、氣相色譜法（NPD）測定。
　　⑵. 樣品處理
　　①. 提取
　　將黃瓜縱向切開，每條取1/4，組織搗碎機搗碎。稱40g勻漿后的黃瓜樣，（土樣為20g，加水10mL），放入250mL錐形瓶中，加入80mL甲醇，加塞，在振蕩機上振蕩提取1h，過濾，濾渣再用80mL甲醇提取1h，過濾，用甲醇多次沖洗濾渣，合并濾液。
　　②. 凈化
　　液－液分配：將提取液轉移到500mL分液漏斗中，加150mL水，20mL飽和氯化鈉水溶液，用2×50mL的二氯甲烷提取。提取液通過裝有無水硫酸鈉的漏斗干燥，二氯甲烷轉移到250mL圓底燒瓶中，在55℃的水浴上濃縮至2～3mL，再用氮氣流吹至微干。
　　柱層析：玻璃層析柱中底部塞上玻璃棉，然后依次加入2cm厚無水硫酸鈉，10g酸性氧化鋁（100～200目。用前在130℃下烘12h，冷卻后，加10％水脫活），2cm厚無水硫酸鈉。用10mL的二氯甲烷將上述的濃縮物轉移到層析柱中，用石油醚/乙醚（9:1，V/V）的混合液淋洗，棄去淋出液。再用50mL石油醚/乙醚（1:1，V/V）的混合液淋洗，收集在250mL圓底燒瓶中,在55℃水浴上濃縮至近干，再用氮氣流吹干。用正己烷溶解，定容后待測。
　　⑶. 氣相色譜測定
　　檢測器：堿火焰離子化檢測器（NPD）；色譜柱：1m（長）×2mm（內徑）玻璃柱；擔體：Chromosorb GAM，80～100目；固定液：3％PEG 20M；檢測溫度：色譜柱220℃，檢測器250℃，進樣口250℃；載氣：氮氣（≥99.99％），30mL/min；燃燒氣：氫氣32mL/min，空氣88mL/min；保留時間：1min12s。該方法的最小檢出量：2.7×10-10g；最低檢出濃度：黃瓜為0.013mg/kg，土壤為0.018 mg/kg�；厥章剩禾砑�0.05～0.25 mg/kg，黃瓜回收率為98.0～98.5％，土壤為94.5％。
　　2. 高效液相色譜方法
　　⑴. 方法原理
　　樣品用甲醇振蕩提取，二氯甲烷液－液分配，酸性氧化鋁柱層析凈化，高效液相色譜法測定。
　　⑵. 樣品處理
　　①. 提取
　　稱取50g切碎的葡萄樣品（土樣為20g，加水10mL），放入250mL錐形瓶中，加入70mL甲醇，加塞，在振蕩器上振蕩1h，過濾，用甲醇多次洗滌濾渣，合并濾液。
　　②. 凈化
　　液-液分配凈化：將上述提取液轉移到500mL分液漏斗中，加100mL的蒸餾水和40mL飽和氯化鈉水溶液，用3×50mL的二氯甲烷提取，提取液經無水硫酸鈉脫水，二氯甲烷轉移到250mL圓底燒瓶中，在45℃的水浴上濃縮至1～2mL，再用氮氣流吹至微干。
　　柱層析凈化：層析柱上下兩端各放1cm厚無水硫酸鈉，中間裝填7g酸性氧化鋁（小于80目，用前在550℃下烘4h，冷卻后加入10％水脫活），用10mL石油醚預淋，再用10mL石油醚將上述濃縮液轉移至柱中，用50mL石油醚/乙醚（9:1，V/V）的混合液淋洗，棄去淋出液。再用50mL石油醚/乙醚（1:1，V/V）的混合液淋洗，收集淋出液于250mL圓底燒瓶中，在45℃的水浴上減壓濃縮至干。再用重蒸的甲醇溶解，定容后待測。
　　⑶. 高效液相色譜測定
　　檢測器：紫外檢測器（UV，波長220nm）；色譜柱：30cm（長）×4mm（內徑）C18不銹鋼柱；流動相：甲醇/水（80:20，V/V）；流速：1mL/min；保留時間：5min48s。該方法的最小檢出量：1.6×10-10g；最低檢出濃度：葡萄0.08 mg/kg，土壤為0.02mg/kg；回收率：葡萄中添加甲霜靈0.1～2.0 mg/kg，回收率為79.4％～85.5％。土壤中添加0.5～2.0 mg/kg，回收率為85.5～95.8％。
　　10.4.3 乙烯菌核利的殘留分析
　　該藥劑屬于酰苯胺類衍生物中的N－取代二甲酰亞胺類。
　　1. 方法原理
　　樣品用丙酮提取，二氯甲烷分配，中性氧化鋁/弗羅里硅土柱層析凈化，用GC-ECD測定。
　　2. 樣品處理
　　⑴. 提取
　　稱取20g黃瓜搗碎樣品（或過篩土樣20g），加入50mL丙酮，振蕩提取30min，過濾，用3×30mL丙酮洗滌合并全部提取液，濃縮至約10mL。將提取液轉移至分液漏斗中（內盛2％Na2SO4水溶液50mL），用3×30mL二氯甲烷振搖液液分配，合并二氯甲烷液，并經無水硫酸鈉干燥，濃縮至2～3mL。
　　⑵. 柱層析凈化：
　　層析柱中上下兩端各加2cm厚無水硫酸鈉，中間上部加4g弗羅里硅土（60～100目，用前經130℃活化6h），下部加4g中性氧化鋁（100～200目，用前經130℃活化4～6h），用30mL淋洗液（二氯甲烷/乙酸乙酯，10:1，V/V）預淋，將樣品濃縮液轉移至柱中，用60mL淋洗液淋洗，收集淋出液并濃縮，定容后待測。
　　3. 氣相色譜測定
　　檢測器：電子捕獲檢測器（ECD，Ni63）；色譜柱：25m（長）×0.25mm（內徑）毛細管柱，固定液：OV-1701；檢測溫度：色譜柱200℃，檢測器250℃，進樣口250℃；載氣：氮氣（≥99.99％），流速50mL/min，尾氣50mL/min；分流比：50:1；保留時間：5min49s。該方法的最小檢出量：1.0×10-11g；最低檢出濃度：黃瓜為0.005mg/kg，土壤為0.01mg/kg；回收率：黃瓜中添加0.2~5.0mg/kg，回收率為87.5~107.6％；土壤中添加0.2~1.0mg/kg，回收率為85.1~108.7％。
　　10.4.4 異菌脲的殘留分析
　　該藥劑屬于酰苯胺類衍生物中的N－取代二甲酰亞胺類。
　　1. 方法原理
　　水果樣品切碎并經組織搗碎后，用丙酮振蕩提取，二氯甲烷液－液分配，弗羅里硅土柱層析凈化，GC-ECD測定。
　　2. 樣品處理
　　⑴. 提取
　　每次取12條香蕉樣品，分開果皮果肉，切碎經組織搗碎2min（為方便搗碎可加入適量蒸餾水），折稱50g蕉肉，20g蕉皮于500mL具塞磨口三角瓶中，各加100mL丙酮，2~4g助濾劑Celite545，浸泡過夜，振蕩提取30min，抽濾，殘渣用50、40、30mL丙酮洗滌，抽濾，濾液濃縮去除丙酮。
　　⑵. 液-液分配凈化
　　濃縮液轉移到500mL分液漏斗中，加5％氯化鈉水溶液50mL，加50mL二氯甲烷，振搖1min靜止分層后收集下層二氯甲烷，上層液體再加40mL二氯甲烷提取，合并二氯甲烷濃縮至近干，待柱層析。
　　⑶. 柱層析凈化
　　層析柱中依次從下至上加入2g無水硫酸鈉，5g弗羅里硅土（用前130℃烘6h），0.5g粒狀活性炭，2g無水硫酸鈉，用40mL二氯甲烷預淋，然后將上述濃縮液用少許二氯甲烷溶解并轉移到層析柱中，再用75mL二氯甲烷／乙酸乙酯（19:1，V/V）淋洗，淋出液濃縮近干，用甲苯定容，待測。
　　3. 氣相色譜測定
　　檢測器：帶電子捕獲檢測器（ECD Ni63）；色譜柱：2m（長）×3mm（內徑）玻柱，5％SE-30/Chromosorb W AW DMCS，80~100目；檢測溫度：色譜柱260℃，檢測器350℃，進樣口300℃；載氣：氮氣（≥99.99％）， 30mL/min ；保留時間：1min20s。該方法的最小檢出量：2.0×10-10g；最低檢出濃度：香蕉肉0.01mg/kg，香蕉皮0.05mg/kg；回收率：添加0.1～5.0mg/kg，香蕉肉為88.2％～105.8%，香蕉皮為82.3％～103.7%。
　　10.4.5 三唑酮的殘留分析
　　該藥劑屬于三唑衍生物類殺菌劑。本方法適用于測定糧食中三唑酮的殘留量。
　　1. 樣品處理
　　糧食：稱取30.0g粉碎過60目的樣品，置于500mL具塞三角瓶中，加80mL丙酮，20mL蒸餾水，浸泡過夜后振蕩提取1h，抽濾，殘渣用30mL丙酮洗滌兩次，合并濾液，濃縮除去大部分丙酮。將提取液轉移到250mL分液漏斗中，依次加入50mL蒸餾水，10mL飽和氯化鈉水溶液，40mL二氯甲烷，振搖2min。下層有機相移至250mL具塞三角瓶中。水相再用20mL二氯甲烷提取一次，棄去水相，有機相經無水硫酸鈉脫水后收集在燒瓶中，在40℃水浴濃縮近干。殘留物用丙酮轉移到刻度試管中，定容到5mL，供GC測定。
　　2. 氣相色譜測定
　　檢測器：NPD；色譜柱：1.6m（長）×3mm（內徑）玻柱，4％OV-17+4％OV-210/Chromosorb W AW DMCS，80～100目；檢測溫度：色譜柱220℃，檢測器290℃，進樣口290℃；載氣：氮氣（≥99.99％），70mL/min；燃燒氣：氫氣3.6mL/min，空氣160mL/min。該方法的最小檢出量：三唑酮2.8×10-10g，三唑醇為5×10-10g；最低檢出濃度：三唑酮為0.01mg/kg，三唑醇為0.02mg/kg；添加濃度0.04~5.0 mg/kg的回收率在84.1%~103%。
　　10.4.6 丙環唑的殘留分析
　　該藥劑屬于三唑衍生物類殺菌劑。該方法用于小麥、植株、土壤中丙環唑的殘留量分析。
　　1. 方法原理
　　樣品用甲醇/水提取，經液－液分配，堿性氧化鋁柱層析凈化，氣相色譜法（NPD或ECD）測定。
　　2. 樣品處理
　　⑴. 提取
　　稱20g小麥籽粒粉碎樣品（或20g土壤樣品，或10g植株樣品），置于500mL具塞三角瓶中，加200mL甲醇/水（8:2,V/V）混合溶液浸泡過夜，振蕩提取2h。提取液通過布氏漏斗過濾。再用2×40mL溶劑重復提取。用少量溶劑洗滌三角瓶及濾渣，合并全部濾液。
　　⑵. 液－液分配凈化
　　將上述的濾液轉入1000mL分液漏斗中，加200mL蒸餾水，50mL飽和氯化鈉水溶液，用2×75mL二氯甲烷提取2次，收集二氯甲烷相，通過裝有無水硫酸鈉的漏斗，二氯甲烷收集后，在旋轉蒸發器40℃水浴上濃縮近干。
　　⑶. 柱層析凈化
　　層析柱底部塞入玻璃棉球，加入20mL石油醚，然后依次加入2cm厚無水硫酸鈉，10g堿性氧化鋁（用前650℃灼燒3h，冷卻后每100g加19g蒸餾水，在旋轉濃縮器中轉動3h或振蕩2h，儲于磨口瓶中，置于干燥器內保存），2cm厚無水硫酸鈉，待石油醚剛剛沒過硫酸鈉時，立即將上述濃縮液用2mL甲苯溶解并轉入柱中，再用2×2mL甲苯洗瓶及柱壁二次，然后用50mL石油醚/二氯甲烷（6:4，V/V）淋洗、棄去淋出液；用75mL二氯甲烷／石油醚（6:4，V/V）淋洗并收集與旋轉濃縮瓶中，在旋轉蒸發器40水浴上蒸去溶劑，改用石油醚／乙醇（1:1，V/V）溶解殘渣并準確定容至2mL，待測。
　　3. 氣相色譜測定
　　檢測器：氮磷檢測器（NPD）；色譜柱：1m（長）×3mm（內徑）玻柱；擔體：Chromosorb Q，80～100目；固定液：3％Carbowax 40M；檢測溫度：色譜柱230℃，檢測器250℃，進樣口250℃；載氣：氮氣（≥99.99％），40mL/min；燃燒氣：氫氣3mL/min，空氣100 mL/min；保留時間：3min36s。該方法的最小檢出量：2.7×10-10g；最低檢出濃度：0.01~0.03mg/kg；回收率：添加0.1~2.0 mg/kg，回收率在90.3％~94.1％。
　　10.4.7腈苯唑的殘留分析
　　該藥劑屬于三唑衍生物類殺菌劑。本方法適用于土壤及水果中腈苯唑的殘留分析。
　　該藥劑在環境中容易光解產生兩種代謝物：RH-9129和RH-9130。在殘留分析中要測定母體及代謝物。
　　1. 樣品處理
　　⑴. 提取
　　稱取20g水果勻漿樣品或20g土壤樣品，加80mL甲醇（土壤需先加水10mL），振蕩30min，用60目石英砂作助濾劑抽濾，濾渣再用80mL甲醇分多次沖洗濾渣并抽濾，合并濾液。甲醇提取液中加180mL水，5mL醋酸鉛飽和溶液，25mL氯化鈉飽和溶液，搖勻，靜置，用另一抽濾漏斗墊石英砂抽濾，再用30mL二氯甲烷沖洗濾渣并抽干。將甲醇及二氯甲烷濾液轉入800mL分液漏斗中，加二氯甲烷50mL×2液-液分配，取二氯甲烷層過無水硫酸鈉脫水后，在60℃水浴中減壓濃縮至近干，用氮氣流吹干溶劑。
　　⑵. 柱層析凈化
　　濕法裝柱，層析柱上下兩端加2cm厚無水硫酸鈉，中間加8g層析用硅膠，用10mL丙酮／石油醚（1:9,V/V）混合溶液將提取液移入柱中，再用50mL丙酮/石油醚（4:6,V/V）混合溶液淋洗，收集此部分淋出液并濃縮至干，定容后待測。
　　2. 氣相色譜測定
　　檢測器：氮磷檢測器（NPD）；色譜柱：15m（長）×0.53mm（內徑）石英交聯毛細管柱，固定液為DB-35；檢測溫度：色譜柱250℃，檢測器270℃，進樣口270℃；載氣：氮氣（>99.99%），14mL/min；燃燒氣：氫氣4mL/min，空氣180mL/min；尾吹氣：氮氣18mL/min；保留時間：腈苯唑為5.33min，RH-9130為6.33min，RH-9129為6.85min。該方法的最低檢出量：1×10-10g；最低檢出濃度：0.01mg/kg；回收率：水果、土壤中添加腈苯唑、RH-9130、RH-9129 0.1~1.0mg/kg，回收率分別在82.4%~95.3%。相對標準偏差在0.2%~11.6%。
　　10.5  農用抗生素
　　10.5.1 概述
　　自從1928年發現青霉素，1944年發現鏈霉素以來，抗生素得到了很快的發展，在農業上也得到了廣泛的應用。當前農用抗生素的來源已經由單純的微生物產生的次生代謝產物，擴展到以微生物產生的活性物質為模板，進行生物合成或結構改造，人工合成抗生素類殺菌劑。目前常用的品種有井岡霉素、公主嶺霉素、滅瘟素、多抗霉素等。本節以多抗霉素為例，介紹該類殺菌劑的殘留分析。
　　10.5.2 多抗霉素在蘋果及土壤中的殘留分析
　　1. 方法原理
　　樣品用甲醇提取，濃縮物過交換樹脂柱、活性炭柱層析凈化，最后以滅菌水定容，待測。
　　2. 主要儀器設備及主要試劑
　　高速搗碎機、旋轉蒸發儀、高速離心機、培養皿、不銹鋼圈。
　　甲醇、乙醇、苯胺、檸檬酸，均為分析純；磷酸氫二鈉、氫氧化鈉為優級醇；滅菌水；活性炭：（1g活性炭放入100mL燒杯中，加入50mL水，煮沸3min，室溫下放置30min，慢慢傾斜出去為粒浮物）；多氧霉素標準樣品：純度1470A.M.U/mg
　　3. 樣品處理
　　蘋果：稱取100g樣本置于高速搗碎機中，加150mL甲醇，搗碎3min。抽濾，用100mL甲醇/水（7:3,V/V）洗滌濾渣，合并濾液于圓底燒瓶中，移至旋轉蒸發儀40℃水浴上濃縮近50mL，用鹽酸調節至pH2.0，高速離心15min；除去沉淀物，濾液以1.5mL/min 過20×200mm的交換樹脂柱，將20mL樹脂裝入柱子，60mL 1/5M檸檬酸／磷酸氫二鈉緩沖液（pH2.0）淋洗，再用60mL水淋洗。然后依次用60mL水1.5mL/min、1000 mL 丙酮／水（1:1,V/V）1mL/min、60 mL 水1.5mL/min淋洗此柱。棄去淋洗液。再用200 mL 0.3mol/L 鹽酸以0.7mL/min淋洗該柱。溶出Polyoxin B。用氫氧化鈉溶液調節淋洗液至pH6.0，淋洗液以2mL/min速率通過15×200min的活性炭柱。再依次用200mL0.01%苯胺溶液、200mL水，以1.5mL/min速率淋洗。再用50mL水2mL/min、1000mL水／乙醇（59:5，V/V）1.5mL/min淋洗此柱，棄去淋出液。用200mL丙酮／水（3:2,V/V）以1.5mL/min速率淋洗，淋洗液收集于圓底燒瓶中，在旋轉蒸發器40℃水浴上濃縮近干，用滅菌水定容，待生物測定。試液濃度Polyoxin B超過1AmU單位時，應該用滅菌水稀釋。
　　土壤：稱取50g樣品放入三角瓶中，加40mL 1M磷酸氫二鉀溶液,置于振蕩器上振蕩30min，抽濾，合并濾液。用鹽酸調至pH6.0 放于冰箱中過夜（5℃），除去沉淀物。濾液以2mL/min的速率通過15×200mm活性炭柱，50mL水以1mL/min速率淋洗，棄去淋出液再用400mL丙酮/水（3:2,V/V）0.5mL/min速率淋洗，并收集于圓底燒瓶中，于旋轉蒸發器40℃左右的水浴上濃縮至近干，用20mL滅菌水定容，待測。
　　4. 生物法測定
　　制備孢子懸浮液：在培養（28℃）7~10天的蘋果輪斑病菌（AlternaninmaliAK1-3）斜面試管內加5mL滅菌水，用接種環輕輕劃動斜面上的菌絲，使孢子懸浮于滅菌水中，用滅菌紗布過濾于三角瓶中制成一定濃度的孢子懸浮液。
　　平面制作：將測定用的培養基熔化，并冷卻至45℃左右加入適量孢子懸浮液，充分混合后迅速取5mL注入滅菌的9cm培養皿內，輕輕搖動培養皿使其形成均勻帶菌培養基平面。
　　SH
　　UL
　　SL
　　UH
　　“SH”內注入1A?m?u（效價）/ml標準液
　　“SL”內注入0.5A?m?u（效價）/ml標準液
　　“UH”內注入高濃度的試液
　　“UL”內注入1/2高濃度試液
　　加樣：培養基平面凝固后，按下圖位置放置不銹鋼圈（內徑6mm，高10mm），并注入表樣各試液。
　　恒溫培養：加樣后的平面培養基放冰箱（4℃）中，5h（讓藥劑充分擴散）后取出，置28℃恒溫箱中培養38～45h，取出測量抑菌圈直徑。
　　5. 結果計算
　　將培養38～45h的培養基平面取出，精確測量抑菌圈直徑（mm，精確至0.5mm），然后按下列公式計算殘留量和回收率。
　　LogQ=
　　（UH、SH、UL、SL代表抑菌圈直徑）
　　Q＝PU/PS
　�。�PU為試液高濃度的效價，單位是A·m·u/mL）
　�。�PS為標準液高濃度的效價，單位是A·m·u/mL）
　　PU=QPS（PS為1A·m·u/mL）
　　殘留量（mg/kg）=
　　校正后殘留量（mg/kg）=殘留量／回收率
　　該方法最低檢出濃度：0.05mg/kg；回收率：蘋果0.5~1.0mg/kg回收率為74~79%，土壤添加0.1～1.0mg/kg回收率為80～81%；變異系數：蘋果2.5～4.1%，土壤5.0～8.7%。