標題高效液相色譜法同時測定血清中頭孢哌酮和舒巴坦的含量

摘要報告了用高效液相色譜法同時測定血清中頭孢哌酮和舒巴坦的含量。本法以外標法為基礎，0.5mL血清標本經甲醇沉淀蛋白，離心后上清液進樣。

　　色譜分析條件：以C18反相柱作分析柱，流動相組成為0.005mmol/L四丁基氫氧化銨—乙腈（825∶175，V/V），磷酸調整pH至5.0，流速為1.0mL/min，在紫外檢測器230nm進行檢測。本法的頭孢哌酮和舒巴坦的最低檢出濃度分別為10mg/L和5mg/L，至少在10～1000mg/L范圍內呈線性，頭孢哌酮和舒巴坦的絕對回收率分別是99.4％～102.9％和95.0％～105.3％，批內和批間RSD分別是1.4％、1.5％和1.8％、1.9％。對10種臨床常用的β-內酰胺類藥物進行干擾實驗，未發現有干擾峰。β-內酰胺酶的產生已迅速波及到許多種類的細菌并且已經成為影響β-內酰胺類抗生素的主要威脅，以至許多頭孢菌素對產β-內酰胺酶的細菌并不具有“深譜”抗菌能力，舒普深（Sulperazon）內含舒巴坦鈉和頭孢哌酮鈉；由于舒巴坦（Sulbactam）是一種強有力的β-內酰胺酶抑制劑，而頭孢哌酮（Cefoperazone）是第三代頭孢菌素類抗生素，具有廣譜的抗菌作用，兩者聯合具有明顯的協同作用，是一種全新的廣譜加上深譜的頭孢菌素類抗生素，在臨床治療中廣泛使用。但如果用藥不當會產生副作用或未達到合理用藥的目的。因此，測定血液中該藥物的濃度，對于研究不同疾病條件下該藥物的作用機理、藥代動力學以及制定合理的給藥方案十分必要。用高效液相色譜法測定舒巴坦和頭孢哌酮的方法已有很多報道，但絕大多數方法是在一個色譜條件下測定一種藥物，為此，筆者建立了一種能同時測定血清頭孢哌酮和舒巴坦含量的高效液相色譜法。該法在保證足夠的靈敏度、精密度和準確度的前提下，達到操作簡便、節約有機溶劑、節省人力和時間的目的。

　　1、測定原理

　　以外標法為基礎，血清樣品經甲醇沉淀蛋白，取上清液過濾，濾液直接進樣，用C18反相柱進行色譜分析，紫外檢測器在230nm波長下進行檢測，以峰面積定量。

　 2、材料和方法

　　2.1 標本的收集和保存抽取血液放入普通玻璃試管中（勿溶血），分離血清后立即測定，如不能立即測定應將血清密封，置4℃冰箱或-20℃下保存，一周內測定。

　　2.2 儀器高效液相色譜儀：包括Waters510泵，486紫外可見光檢測器，U6K進樣閥，PC800色譜工作站，AST486微機。平頭微量注射器：Hamilton25μL，美國。樣品過濾器：NewHydePark，日本。樣品過濾膜：Millipore0.5μm，美國。離心沉淀機：LXJ—Ⅱ型，南京第一醫療器械廠生產。

　　2.3 試劑標準物：頭孢哌酮（純度為93.8％）和舒巴坦（純度為99.5％）均由中國大連輝瑞制藥有限公司提供。溶劑：四丁基氫氧化銨和磷酸為國產分析純試劑；乙腈和甲醇為國產色譜試劑；水為Millipore超純水器生產。

　　2.4 溶液配制

　　標準液：室溫下分別配制濃度為1g/L的頭孢哌酮和舒巴坦的甲醇溶液，密封。置4℃冰箱保存，用前取出放至室溫后使用。血清標準應用液：參考舒普深血清藥代動力學資料，確定兩藥物標準曲線各點的血清藥物濃度（表1）。用健康正常人無藥混合血清配制。將不同濃度的血清標準應用液分裝，密封，置-20℃保存，至少在二周內是穩定的。

　　2.5 樣品預處理取所需數目的6mL圓底帶塞試管，于試管中分別加入標準血清應用液、空白無藥血清和病人標本各0.5mL。于各管中準確加入甲醇0.5mL，旋渦1min，離心（3000r/min）15min。吸取上清液過濾，取濾液20μL進樣。

　　2.6 色譜分析條件分析柱：Nova-PakR○C184μm，3.9mm×150mm，檢測波長：UV230nm，流速：1.0mL/min。柱溫：室溫。

　　2.7 計算在PC800色譜工作站中設置好各有關參數，得出頭孢哌酮和舒巴坦的血清標準物的峰面積。以各藥標準血清的峰面積為縱坐標，其相應的血藥濃度為橫坐標，分別繪制各藥的標準曲線。由待測標本的峰面積，在標準曲線上查出其相應的血藥濃度。亦可根據各藥的峰面積與血藥濃度的回歸方程，計算標本的血藥濃度。

　　3、結果

　　3.1 檢出限以引起兩倍于噪音的藥量為最低檢出量，以經預處理后的進樣藥量等于最低檢出量的標本藥物濃度為最低檢出濃度。本法的最低檢出濃度分別是：頭孢哌酮為10mg/L，舒巴坦為5mg/L。

　　3.2 干擾實驗在上述色譜條件下，對10種臨床常用的β-內酰胺類藥物（氨芐青霉素、羥氨芐青霉素、青霉素G鈉鹽、氧哌嗪青霉素、克拉維酸、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢唑啉、頭孢呋辛進行了干擾實驗，均未發現有干擾峰。

　　4、討論

　　4.1 色譜體系的選擇在分析堿性藥物時，多采用反相柱，它可使血液中的內源性強極性成分快速洗脫下來，避免對測定藥物的干擾，同時也縮短了測定時間，筆者采用了C18反相柱進行分離。固定相確定以后，流動相的組分對被測物的色譜分離起著決定性的作用，筆者曾試用甲醇（多種比例）作為流動相中的強溶劑，分離度和峰形均不令人滿意，改用乙腈作為強溶劑和用四丁基氫氧化銨作為添加劑，且按照一定比例配制及調整pH，就獲得了滿意的分離度。

　　4.2 樣品的預處理本法樣品處理操作簡單、快速，試劑易得，基本上能滿足臨床檢測的要求，如需提高檢測靈敏度，還需要將提取液進一步濃縮和重組，然后再進樣分析，此有待進一步摸索改進。

　　4.3 方法概述和應用實例采用本實驗所設計的流動相能將舒普深中頭孢哌酮和舒巴坦完全分離，雖然舒巴坦中常含有堿性降解物，但它并不干擾本法含量測定；分離后雖然用外標法以峰面積計算出組分的含量。但由于樣品處理過程簡單，人為影響因素少，且通過多次實驗證明本法的特異性強，靈敏度較高，重現性和回收率結果良好，另外，通過比較，無論是用峰面積或是峰高計算結果，均無明顯差別。本方法建立以后，已對臨床90多人次燒傷病人用藥后的血清標本進行了測定，未發現內源性物質和藥物的代謝產物的干擾，說明本法能夠滿足對舒普深臨床血藥濃度和藥代動力學監測的要求。