標題熒光分光光度法測定大黃中游離蒽醌的含量

【摘要】 目的采用熒光分光光度法，建立了大黃中游離蒽醌類成分含量測定的方法。方法以丙酮為溶劑，在λex =460 nm 和λem =540 nm處測定熒光強度。結果測得游離蒽醌含量在0.25～3.0 μg/ml范圍內呈良好的線性關系，線性回歸方程為F=122.81C 46.224（r=0.999 6）,最低檢測限為0.25 μg/ml，表明該法靈敏度高、重現性較好，且操作簡便。結論該研究為測量大黃中活性成分游離蒽醌提供了一種有效可靠的分析方法。

　　【關鍵詞】 大黃； 游離蒽醌； 熒光分光光度法

　　有效成分含量是評價藥材質量的重要指標，現報道的大黃中游離蒽醌檢測方法主要有比色法、薄層色譜（TLC）法、高效液相色譜法（HPLC）、毛細管膠束電泳色譜法（MECC）及毛細管電泳色譜法（CEC）。色譜方法通常需要較長的分離分析時間，與之相比光譜法具有顯而易見的快速特點；同時熒光分光光度法可用于藥物的微量或恒量物質分析，并具有靈敏度高、選擇性強、試樣量少和方法簡便等優點，因此在藥物定量尤其是中藥有效成分檢測上的應用日趨廣泛。已有利用熒光分光光度法測定中藥決明子中總蒽醌含量測定的報道［1］。本實驗利用羥基蒽醌的熒光特性，在丙酮溶液中，建立了中藥大黃中游離蒽醌熒光測定的新方法。

　　1 儀器與試藥

　　1.1 儀器電子天平（上海精密科學儀器有限公司FA1004型），KQ-500B型超聲器（昆山市超聲儀器有限公司），LD4-2型低速離心機（北京醫療離心機廠），RE-52A型旋轉蒸發器（上海正榮生化儀器廠），970CRT熒光分光光度計（上海精密儀器有限公司）。

　　1.2 材料1，8�捕�羥基蒽醌對照品（中國藥品生物制品檢定所），95%乙醇（沈陽市東陵區紅日化工廠）、丙酮（盛森試劑有限公司）均為分析純，大黃藥材（購自錦州市藥材公司），水為亞沸高純去離子水。

　　2 方法與結果

　　2.1 測定波長的選擇用2 ml 3.1 μg/ml的1，8�捕�羥基蒽醌標準液在300～600 nm波長范圍內進行激發波長掃描，蒽醌的最大激發波長（λex）為460 nm，固定該激發波長，掃描得發射譜圖，得到其發射波長（λem）為540 nm。結果見圖1。

　　圖1 蒽醌標準液的激發波長和熒光波長（略）

　　選擇該最大激發波長和最大發射波長（即λex/λem=460 nm/540 nm）作為后繼測定的工作條件。

　　2.2 標準曲線的制備精密稱取105℃干燥至恒重的1.8�捕�羥基蒽醌2.5 mg置50 ml棕色容量瓶中，加丙酮溶解并稀釋至刻度，搖勻得對照原液。精密量取對照原液0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 ml分別置10 ml棕色容量瓶中，用丙酮定容，以丙酮試劑為空白，在λex =460 nm 和λem=540 nm處測其溶液的熒光強度，結果表明溶液的熒光強度（IF）與溶液濃度（C）在0.25～3.0 μg/ml范圍內呈良好的線性關系。見圖2。

　　圖2 游離蒽醌熒光強度標準曲線圖（略）

　　2.3 條件考察

　　2.3.1 溶劑的影響 選擇丙酮、甲醇、氯仿試劑，考察了對反應體系的影響，結果表明樣品在丙酮中熒光強度大、靈敏度高，且空白溶劑在此范圍內幾乎無熒光吸收（與文獻報道一致［2］），在激發波長為460 nm、發射波長為540 nm處，其拉曼光較小，對實驗影響較小，圖像也較直觀，故本實驗選用丙酮作溶劑，見圖3。

　　圖3 丙酮、甲醇、氯仿熒光效果圖（略）

　　2.3.2 放置時間對游離蒽醌熒光強度的影響依照分析步驟,測定放置不同時間后的1，8-二羥基蒽醌的相對熒光強度。結果見表1。從表1中可以看出,隨著放置時間的延長，相對熒光強度逐漸減小，熒光強度在0～3 h內基本穩定，因此應保證在3 h內測定熒光。

　　表1 放置時間對游離蒽醌熒光強度的影響（略）

　　2.4 樣品的測定

　　2.4.1 樣品溶液的制備取攝氏60℃干燥1 h的大黃粗粉80 mg，加50 ml 95%乙醇，先在25 kHz頻率下超聲20 min，然后水浴上加熱至微沸，回流1.5 h，采用3 000 r/min的轉速離心30 min，取上清液，殘渣再加50 ml 95%乙醇液加熱回流30 min，離心取上清液，合并兩次上清液，濃縮后揮去乙醇，殘渣加二次蒸餾水10 ml，1 mol/L NaOH 2滴、氯仿15 ml，分離后將水溶液于冰水浴中并加乙醚10 ml、鹽酸0.4 ml后立即密封振搖3 min，靜止分層，如此方法萃取3次合并乙醚液，揮盡乙醚后加50 ml丙酮，得樣品溶液。

　　2.4.2 精密度實驗分別精密吸取樣品溶液1 ml于5個10 ml棕色容量瓶中，加丙酮定容。在λex/λem=460 nm/540 nm下測熒光強度。結果見表2。RSD為0.3%，表明該方法的精密度良好。

　　表2 精密度實驗結果（略）

　　2.4.3 重現性實驗精密稱取大黃粗粉80 mg 5份，按樣品溶液的制備項下的方法制備樣品液，在λex/λem=460 nm/540 nm下測熒光強度。結果見表3。RSD為1.5%，表明該方法的重現性良好。

　　表3 重現性實驗結果（略）

　　3 討論

　　蒽醌母核是一個具有長共軛體系的化合物, 且游離蒽醌的結構上都有多個取代基－OH，更增加了分子的π電子共軛程度，故熒光強度較強；由于游離蒽醌在丙酮中的熒光強度較大、 穩定性好，無干擾， 故實驗文選定丙酮為測定溶劑。

　　研究結果表明利用熒光分光光度法測定大黃中游離蒽醌的含量， 具有取樣量小、操作簡便、快速靈敏的特點 ,可用于人體血清、尿樣中的大黃中游離蒽醌的定量分析。
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