標題質粒DNA的分離、純化和鑒定 （三）

操作步驟
　　 一、 細菌的培養和收集
　　 將含有質粒pBS的DH5α菌種接種在LB固體培養基（含50μg/ml Amp）中, 37℃培養12-24小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5ml LB液體培養基（含50μg/ml Amp）中,37℃振蕩培養約12小時至對數生長后期。
　　 二、 質粒DNA少量快速提取
　　 質粒DNA小量提取法對于從大量轉化子中制備少量部分純化的質粒DNA十分有用。這些方法共同特點是簡便、快速，能同時處理大量試樣,所得DNA有一定純度,可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。
　　 （一）、煮沸法
　　 1、將1.5ml培養液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ離心30秒。
　　 2、棄上清，將管倒置于衛生紙上幾分鐘，使液體流盡。
　　 3、將菌體沉淀懸浮于120ml STET溶液中, 渦旋混勻。
　　 4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml）, 渦旋振蕩3秒鐘。
　　 5、將eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
　　 6、用微量離心機4℃下12000g離心10分鐘。
　　 7、用無菌牙簽從eppendorf管中去除細菌碎片。
　　 8、取20ml進行電泳檢查。
　　 [注意] 1. 對大腸桿菌可從固體培養基上挑取單個菌落直接進行煮沸法提取質粒DNA。
　　 2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,濃度高時,細菌裂解效果反而不好。有時不同溶菌酶也能溶菌。
　　 3. 提取的質粒DNA中會含有RNA,但RNA并不干擾進一步實驗,如限制性內切酶消化,亞克隆及連接反應等。
　　 （二）、 堿法
　　 1、取1.5ml培養液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g離心30秒。
　　 2、棄上清,將管倒置于衛生紙上數分鐘,使液體流盡。
　　 3、菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中（需劇烈振蕩）,室溫下放置5-10分鐘。
　　 4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數次,以混勻內容物（千萬不要振蕩）,冰浴5分鐘。
　　 5、加入150μl預冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒,使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4℃下12000g離心5-10分鐘。
　　 6、上清液移入干凈eppendorf管中,加入等體積的酚/氯仿（1:1）,振蕩混勻,4℃下12000g離心5分鐘。
　　 7、將水相移入干凈eppendorf管中,加入2倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。
　　 8、棄上清,將管口敞開倒置于衛生紙上使所有液體流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g離心5-10分鐘。
　　 9、吸除上清液,將管倒置于衛生紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥。
　　 10、將沉淀溶于20μl TE緩沖液（pH8.0，含20μg /ml RNaseA）中，儲于-20℃冰箱中。
　　 [注意] 1. 提取過程應盡量保持低溫。
　　 2. 提取質粒DNA過程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨用酚或氯仿好,要將蛋白盡量除干凈需多次抽提。
　　 3. 沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低溫條件下放置時間稍長可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用異丙醇（一般使用等體積）,且沉淀完全,速度快,但常把鹽沉淀下來,所以多數還是用乙醇。
　　 （三）、Wizard少量 DNA 純化系統
　　 Promega公司的Wizard少量DNA純化系統可快速有效的抽提質粒DNA,整個過程只需15分鐘。提取的質�？芍苯佑糜贒NA測序、酶切分析和體外轉錄等。
　　 該系統中所含試劑和柱子可以用于50次1-3ml質粒培養液的分離和純化，試劑包括10ml細胞懸浮液，10ml細胞裂解液；10ml中和液，50ml Wizard少量DNA純化樹脂，50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml ）和50支Wizard微型柱。
　　 1、 1-3ml過夜培養細胞液4℃下 12000g離心1-2分鐘。
　　 2、去除上清液，菌體細胞懸浮于200μl 細胞懸浮液中,充分混合,并移入eppendorf管中。
　　 3、 加200μl 細胞裂解液, 顛倒離心管數次,直到溶液變清亮。
　　 4、加200μl 中和液,顛倒離心管數次。
　　 5、4℃下12000g離心5分鐘，取上清液于新的eppendorf管中。
　　 6、加1ml Wizard少量 DNA 純化樹脂,顛倒離心管數次以充分混勻。
　　 7、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒與Wizard微型柱連接,用移液槍將上述混合液加入注射筒中,并用注塞輕推,使混合物進入微型柱。
　　 8、將注射器與微型柱分開,取出注塞, 再將注射筒與微型柱相連,加入2ml柱洗液,并用注塞輕推，使柱洗液進入微型柱。
　　 9、取出微型柱置于eppendorf管中,離心2分鐘以除去微型柱中的柱洗液。
　　 10、將微型柱放在一個新eppendorf管中，加50μl TE（或水）于微型柱中，靜止1分鐘后，4℃下12000g離心20秒。
　　 11、丟棄微型柱，將eppendorf管中的質粒DNA貯于4℃或-20℃冰箱。
　　 [注意] 樹脂使用前應充分混勻,如有結晶,可將樹脂用25-37℃水浴處理10分鐘。
　　 三、質粒DNA的大量提取和純化
　　 在制作酶譜、測定序列、制備探針等實驗中需要高純度、高濃度的質粒DNA,為此需要大量提取質粒DNA。大量提取的質粒DNA一般需進一步純化,常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。
　　 （一）、堿法
　　 1、取培養至對數生長后期的含pBS質粒的細菌培養液250ml，4℃下5000g離心15分鐘,棄上清,將離心管倒置使上清液全部流盡。
　　 2、將細菌沉淀重新懸浮于50ml用冰預冷的STE中（此步可省略）。
　　 3、同步驟1方法離心以收集細菌細胞。
　　 4、將細菌沉淀物重新懸浮于5ml溶液I中,充分懸浮菌體細胞。
　　 5、加入12ml新配制的溶液II, 蓋緊瓶蓋,緩緩地顛倒離心管數次,以充分混勻內容物,冰浴10分鐘。
　　 6、加9ml用冰預冷的溶液III, 搖動離心管數次以混勻內容物,冰上放置15分鐘,此時應形成白色絮狀沉淀。
　　 7、4℃下5000g離心15分鐘。
　　 8、取上清液,加入50ml RNA酶A（10mg/ml）, 37℃水浴20分鐘。
　　 9、加入等體積的飽和酚/氯仿,振蕩混勻,4℃下12000g離心10分鐘。
　　 10、取上層水相, 加入等體積氯仿,振蕩混勻,4℃下12000g離心10分鐘。
　　 11、取上層水相,加入1/5體積的4mol/L NaCl和10% PEG（分子量6000）, 冰上放置60分鐘。
　　 12、4℃下12000g離心15分鐘, 沉淀用數ml 70%冰冷乙醇洗滌，4℃下12000g離心5分鐘。
　　 13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中。
　　 [注意] 1. 提取過程中應盡量保持低溫。
　　 2. 加入溶液II和溶液III后操作應混和,切忌劇烈振蕩。
　　 3. 由于RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐熱的特性,使用時應先對該酶液進行熱處理（80℃ 1小時）,使DNA酶失活。
　　 （二）、Wazard大量DNA純化系統
　　 堿法大量提取DNA往往需要很長的時間.Promega公司的Wiazrd大量DNA純化系統既簡單又快速,只需要離心和真空抽干,這個系統可以從500ml培養液中在3小時以內獲得1mg以上的高質量的質粒DNA（200-20000bp）。該系統不需要酚和氯仿抽提,純化后的DNA溶于水或TE緩沖液中，不含任何鹽份，可以直接用于DNA序列分析和酶切反應，也可以用于在核酸酶抑制劑（如RNasin）存在的條件下進行體外轉錄反應等。
該系統中含有的試劑和柱子可以用于10次100-500ml質粒培養液的分離和純化,試劑包括: 150ml 細胞懸浮液，150ml 細胞裂解液，150ml 中和液，100ml Wizard 大量DNA純化樹脂，125ml Wizard柱子洗脫溶液和10支 Wizard帶有存儲離心管的柱子。
　　 1、100-500ml細胞培養液置離心管中, 22-25℃下5000g離心10分鐘, 所得細胞沉淀充分懸浮于細胞懸浮液中。
　　 2、 加15ml細胞裂解溶液并輕輕混合,可以反復倒置混合,但不能用渦旋振蕩,細胞裂解完全時,溶液會變清,這一步需要20分鐘。
　　 3、 加15ml中和溶液,立即反復倒置離心管數次，并使之混勻。
　　 4、 14000g,22-25℃離心15分鐘。
　　 5、 小心地將上清液吸出并移至一個新離心管中。
　　 6、 加0.5倍體積的異丙醇,混合均勻, 14000g 22-25℃下離心15分鐘。
　　 7、 棄上清,懸浮DNA沉淀于2ml TE緩沖液中。這一步中也許有的沉淀不能溶解。
　　 8、 加10ml Wizard大量DNA純化樹脂溶液, 并渦旋混合。
　　 9、每一個樣品,使用一支Wizard大量柱子,柱子的頭插在真空器上（Promega產品,與此配套）。
　　 10、將樹脂/DNA混合液轉入柱子中,真空抽取樹脂/DNA混合液。
　　 11、將樹脂/DNA混合液抽干后,加13ml柱子洗脫溶液至離心管中, 對管底部的樹脂/DNA進行洗脫（柱子一邊旋轉一邊加入洗脫液），并加入柱子中。
　　 12、真空抽干所加入的洗脫。
　　 13、 再加12ml柱子洗脫液進柱子并抽干。
　　 14、 加入5ml 80％乙醇漂洗柱中的樹脂, 柱子真空抽干后將柱子放入用戶提供的離心管中,2500rpm（1300g）離心5分鐘。
　　 15、 取出柱子，真空抽干5分鐘,再將柱子放入系統中所提供的離心管中，2500rpm（1300g）離心5分鐘。
　　 16、在柱子中加入1.5ml 65-70℃預熱過的滅菌重蒸水或TE,1分鐘后2500rpm（1300g）離心柱子/離心管5分鐘。
　　 17、 取出柱子,離心管中溶液即為提取的質粒DNA,可以直接放在離心管中,蓋上蓋子，儲存在4℃或-20℃備用。
　　 [注意] 1. 在使用之前,系統所提供的柱子洗脫液按1:1加入125ml 95％乙醇。
　　 2. 純化樹脂必須混勻后再用.
　　 （三）、Sephrose 2B柱純化質粒DNA
　　 堿法提取的質粒DNA即使用RNA酶處理,仍會含有少量RNA。當有些試驗需無RNA污染的DNA制品時,則需進行進一步純化。一般常用Sepharose 2B或Sepharose 4B進行純化,該方法具有快速,條件溫和,重復性好,載體物質可以再利用等優點,因而已廣泛用于質粒DNA純化。
　　 1、將Sepharose 2B經含0.1% SDS的TE（pH8.0）平衡后上柱。
　　 2、將至多1ml的DNA溶液鋪在Sepharase 2B柱上。
　　 3、待DNA溶液完全進入柱內后立即在柱的上部連接含有0.1% SDS的TE（pH8.0）貯液瓶。
　　 4、以1ml流出液為1份進行收集。
　　 5、對每一管測定其OD260值,以確定哪些管中含有質粒DNA。通常質粒DNA在柱上流出的第一個峰中。
　　 6、合并所有含質粒的洗脫液,用等體積的酚/氯仿（1:1）抽提,4℃下12000g離心2分鐘,將上層水相轉入新管。
　　 7、加入2倍體積的冰冷無水乙醇，-20℃下沉淀10分鐘,然后4℃下12000g離心10分鐘,棄去上清液。
　　 8、沉淀加70%乙醇洗滌,4℃下12000g離心10分鐘,棄去上清液。
　　 9、 沉淀真空抽干,重新溶于TE或無菌水中。
　　 [注意] 在裝柱過程中,要防止柱床中出現斷裂或氣泡現象,要使界面保持平整。對新裝成的柱,應用含0.1% SDS的TE平衡, 以使柱內的凝膠均勻。

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