標題PITC為柱前衍生試劑的氨基酸分析

摘要：

采用異硫氰酸苯酯（PITC）為柱前衍生試劑進行氨基酸衍生，二元流動相程序洗脫方法分離17種常見氨基酸，分離效果好，無需柱后反應裝置，反應速度快，保留時間重現性好。

實驗部分：

儀器與試劑：

Labtech LC600高效液相色譜儀；Labtech 氨基酸色譜柱（5um, 250×4.6mm）；17種氨基酸標樣；乙腈（色譜純）；水（超純水）；醋酸鈉（分析純）；醋酸（分析純）；三乙胺；異硫氰酸苯酯。

色譜條件：

流動相A：乙腈/B＝1/1（V：V），流動相B：50mmolNaAC緩沖溶液（PH=6.5）流速：1ml/min，進樣1uL（自動進樣方式），檢測波長：254nm，柱溫為40℃。

梯度程序：

柱前衍生步驟：

1.      17種氨基酸混合標準溶液：分別稱取適量天門東氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、胱氨酸于容量瓶中，以0.1N鹽酸定容，得到2.5mmol/L混合標準貯備液（其中胱氨酸1.25mmol/L）。

2.      1mol/L三乙胺乙腈溶液：取三乙胺139ul，加乙腈860ul。

3.      1mol/L異硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液：取12ulPITC加乙腈988ul。

4.      對照品溶液的衍生：取氨基酸溶液800ul置離心管中，加1mol/L異硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液400ul，1mol/L三乙胺乙腈溶液400ul，混勻，室溫放置1小時，加入正己烷1.6ml，放置10分鐘，取下層溶液進樣。

結果與討論：

   取衍生好的氨基酸標準溶液樣品，連續測定10次，因第一次進樣系統未完全平衡好，保留時間有漂移，最后一次進樣由于室內溫度較高，考慮到樣品放置時間長可能會對峰面積有影響，故舍去第一與最后一次進樣，統計8次進樣結果和重疊色譜圖如下，

氨基酸重復性結果（n＝8）

8次重復進樣色譜圖

從數據可得知保留時間有較好的重現性，最大RSD0.31%，由于進樣1ul，進樣量較小，所以峰面積的RSD稍大，在實際測定工作當中可以加大進樣量和添加內標的方式改善。