標題測定血清中21種元素的前處理方法研究

方法:采用1%硝酸，1% TtitonX-100，0.01%吡咯二硫代氨基甲酸銨與1%乙醇混合溶劑稀釋血清樣品20倍后，進入ICP-MS 儀器檢測 Mn、Co、Ni、Cd、La、Ce、W、Hg、Tl、Mo、Sb、Fe、Cu、Zn、Se、Al、As、Sr、Pb、Sn 和 Cr 21 種元素的含量。

結果:血清中21種元素在線性范圍內線性良好（r＞0.995）；檢出限為0.14～15.90 μg/L。方法用于孕婦血清樣本檢測，低高濃度2個水平的血清加標回收率為82.2%～121.5%，相對標準偏差小于10%。采集639名孕婦血清樣本進行檢測，21種元素中除Tl、W、La、Ce、Hg ，其余元素均有檢出。

結論:通過條件優化，采用混合溶劑稀釋法聯合ICP-MS對血清中21種金屬元素分析，方法快速、簡便、準確，適宜用于評估人體元素暴露水平。

目發現的金屬元素有80余種，人體中含有60余種，其中占人體總質量0.01%的微量元素有20余種如鐵、銅、鋅、鈷、錳、鉻、硒、鎳、鉬、錫等，雖然在人體內的含量較低，但它們是構成細胞結構必不可少的成分，在人體代謝和生理過程中發揮著重要作用；還有一些重金屬元素不是生命活動所必須，且超過一定濃度都對人體有毒如鎘、鉛、砷、汞等。人體可通過食品、飲水、空氣等攝入元素，為了準確高效的監測人體元素暴露水平，評估其健康效應，建立血清中多元素同時分析方法是必要的。

雖然目多元素檢測的方法已較成熟，在常用的原子吸收分光光度法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體原子發射光譜法和電感耦合等 離子體質譜法（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）中，ICP-MS法的寬線性范 圍、高靈敏度和強抗干擾能力，使其在多元素分析 中具有不可比擬的優勢，應用范圍越來越廣，尤其 在生物樣品檢測中，ICP炬焰的超高溫，使得樣品經 簡單處理也能獲得滿意的效果。不同的元素在體內的存在形態不同，溶出所需條件亦有差異，雖 已有 ICP-MS 測定血清元素的諸多報道，但筆者在 實驗中發現，樣品處理的不同會帶來大的影 響，要兼顧各元素分析，獲得靈敏準確的結果尚屬不易。因此本文通過重點優化血清樣品處理條件，選擇21種常見金屬元素進行ICP-MS分析，構 建出一種快速、準確的檢測方式，并用于孕婦血清樣品的批量分析。

材料與方法

材料: 樣品來源于 臨床檢驗樣品，血樣采集后進行血清分離，將 血清分裝并放入凍存盒中，于－80 ℃冰箱保存。

儀器: 電感耦合等離子體質譜儀(上海美析儀器有限公司)

標準品和試劑：購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心的21種待測元素標準溶液⁵⁵ Mn、⁵⁹ Co、⁶⁰ Ni、¹¹¹ Cd、¹³⁹ La、¹⁴⁰ Ce、¹⁸² W、²⁰¹ Hg、²⁰⁴ Tl、⁹⁶ Mo、¹²² Sb、⁵⁶ Fe、⁶⁴ Cu、⁶⁶ Zn、⁷⁸ Se、²⁷ Al、⁷⁵ As、⁸⁸ Sr、²⁰⁸ Pb、¹¹⁸ Sn和⁵² Cr，濃度1000 μg/mL。

5種內標元素標準溶液：⁴⁵ Sc、⁷² Ge、¹¹⁵ In、¹⁵⁹ Tb和²⁰⁹ Bi，自國家有色金屬及電子材料分析測試中心購入，濃度為1 000 μg/mL。

硝酸（BV-III ），購自北京化學試劑研究所。Triton X-100（LR），購自Sigma-Aldrich公司。乙醇和四甲基氫氧化銨均為分析純。

實驗方法

ICP-MS儀器條件：通過自動調諧和優化，確定ICP-MS 條件為：射頻功率1550 W，載氣流速 1.05 L/min，采樣深度 8.0 mm，霧化器泵速 0.10 rps， 霧化室溫度2 ℃，提取透鏡－200.0 V；四桿偏轉電 壓－3.0 V；八桿射頻功率150 V，能量歧視5.0 V。 各元素均選擇He模式進行測定，八桿碰撞池He 氣流速1.0 L/min。

樣品稀釋劑配制：實驗采用1%硝酸（BV Ⅲ）溶液，1%TtitonX-100 溶液，0.01%吡咯烷二硫 代氨基甲酸銨與 1%乙醇混合作為樣品稀釋劑。 具體配制方法：以配制 1 000 mL稀釋劑為例，加入 硝酸 10 mL，曲拉通 X-100 0.5 g，吡咯烷二硫代氨 基甲酸銨 0.10 g，乙醇 10 mL，用純水溶解并定容至 1000 mL，充分混勻后置4 ℃保存。

標準溶液配制和標準曲線制定 參考21種 元素在血清中的濃度，分為3個濃度系列配制標準 應用液，其中Mn、Co、Ni、Cd、La、Ce、W、Hg、Tl、Mo 和Sb為同一系列濃度，元素應用液濃度為40 μg/L； As、Sr、Pb、Sn、Cr為同一系列濃度，元素應用液濃度 為100 μg/L；Fe、Cu、Zn、Se和Al為同一系列濃度，元素應用液濃度為1 000 μg/L。分別吸取混合標準應用液 0 μL、50 μL、100 μL、200 μL、500 μL、1 000 μL，定容至10 mL，配制成標準系列濃度：Mn、Co、Ni、Cd、La、Ce、W、Hg、Tl、Mo 和 Sb 標準系列濃度為 0 μg/L、0.20 μg/L、0.40 μg/L、0.80 μg/L、2.00 μg/L、4.00 μg/L；As、Sr、Pb、Sn和Cr標準系列濃度為0 μg/L、0.50 μg/L、1.00 μg/L、2.00 μg/L、5.00 μg/L、10.00 μg/L；Fe、Cu、Zn、Se 和 Al 標 準 系 列 濃 度 為 0 μg/L、5.00 μg/L、10.00 μg/L、20.00 μg/L、50.00 μg/L、100.00 μg/L。

將上述標準系列溶液注入 ICP-MS 中進行分 析，以各待測元素濃度為橫坐標，各待測元素與相 應內標元素的響應值比值為縱坐標，繪制標準曲 線。選擇與待測元素原子量接近的內標進行相應的校正。

方法學驗證 從靈敏度（檢出限）、精密度（相 對標準偏差）和準確度（回收率）3方面進行方法學 驗證，以考察方法性能，數據分析通過 Excel 2007 進行計算。通過平行測定混合血清10次，以測定值 的 3 倍和 10 倍標準差對應的濃度計算檢出限 （LODs）和定量限（LOQs）；吸取混合血清樣品9份， 其中 3 份用于測定本底值，另取 6 份分別加入定量 限和 2 倍定量限水平的標準溶液，在 1 日內重復測 定6次和6日內重復測定21種元素的含量，計算測 得值的相對標準偏差值（RSDs）和加標回收率。

樣品分析 采集血樣后分離血清，將血清分裝 于0.5mL離心管內，編號并放入凍存盒內，－80 ℃冰 箱保存。實驗取出于室溫下解凍。吸取100 μL血 清樣品于5mL塑料離心管中，加入稀釋劑：1%硝酸 （BV Ⅲ）溶液，1%TtitonX-100溶液，0.01%吡咯烷 二硫代氨基甲酸銨與1%乙醇直接稀釋20倍，渦旋 混勻，10 000 r/min離心2 min，取上清進樣分析。質 控血清以同樣方式進行處理。

樣品分析的質量控制 每批次上機和每測30個樣品后進行質控檢測，包括程序空白、平行樣和質控樣品。程序空白實驗是指處理過程中，除不加樣品外，其他步驟同1.3樣品分析，用于監測整個實驗分析階段中待測元素的干擾，若在進樣液中檢出待測元素，則需排除原因后重新測定。平行樣指對同一血樣進行相同的處理和分析，2次檢測結果差值應不超過平均值的10%，否則需排除原因后重新分析。ClinChek微量元素質控樣檢測，測得值與標準值的相對偏差均在參考值范圍內。

ICP-MS 測定模式選擇 采用碰撞反應模式（He）和標準模式（No gas）考察了ICP-MS的測定模式，通過加標樣品分析，各元素在He模式下的回收率均優于 No gas 模式，回收率在 80%～120%范圍內。因此實驗選擇在He模式下進行測定。

樣品處理方式優化

直接稀釋法與微波消解法的比較 ICP-MS測定時常用的樣品處理方式有微波消解法和直

接稀釋法。消解法對有機物的消解能力強，能更有效降低樣品的基質效應，但操作相對繁瑣，消解過程中待測元素易受到污染和損失。ICP-MS采用超高溫的ICP炬焰，對物質進行離子化的同時，也可使樣品基質高溫下徹底灰化，因此一些液態樣品經過簡單的處理如稀釋、過濾等，即可引入儀器進行元素測定。實驗比較了直接稀釋法和微波消解法的加標樣品回收率，結果表明采用消解法，Al、Pb等元素空白值偏高（＞2.0 μg/L）且相對標準偏差大（15%～30%），并且由于加熱趕酸會造成Hg元素損失，回收率偏低（低于70%）；直接稀釋法的元素回收率均較為理想（高于80%），空白可以得到有效控制。因此，實驗選擇直接稀釋法進行樣品處理，并進一步優化了稀釋劑組合和稀釋倍數。

稀釋劑選擇 稀釋溶劑一般使用水和一定濃度的硝酸，為了提高測定靈敏度，可加入非離子

性表面活性劑或有機試劑如曲拉通X-100、乙醇，以及金屬絡合劑如吡咯烷二硫代氨基甲酸銨，同時防止未溶解的生物蛋白物質堵塞 ICP-MS 霧化系統。與酸性稀釋劑相比，堿性稀釋劑如四甲基氫氧化銨，可減少酸度對ICP-MS的干擾，又可以快速消除記憶效應。綜上，參考美國疾病預防控制中心測定標準（DLS 3016.8. Blood Metals Panel 2 （BMP2）ICP-DRC-MS.）和中國團體標準（T/WSJD 19.1—2021，全血中 23 種元素的電感耦合等離子體質譜法），實驗擬采用 1%硝酸溶液、0.05%Triton-100、0.01%吡咯烷二硫代氨基甲酸銨、1.0%，v/v 四甲基氫氧化銨、1%乙醇作為稀釋溶劑，并采取以下4 種組合方式進行實驗，選取優稀釋劑組合。方法①：四甲基氫氧化銨（1.0%，v/v）＋曲拉通 X-100（0.05%）＋吡咯烷二硫代氨基甲酸銨（0.01%）＋乙醇（1%，v/v）；方法②：曲拉通X-100（0.05%）＋吡咯烷二硫代氨基甲酸銨（0.01%）＋乙醇（1%，v/v）（色譜純為佳）＋硝酸（1.0%，v/v）；方法③：曲拉通 X100（0.05%）＋硝酸（1.0%，v/v）＋吡咯烷二硫代氨基 甲酸銨（0.01%）；方法④：曲拉通X-100（0.05%）＋硝 酸（1.0%，v/v）＋乙醇（1%，v/v）。

經過幾種組合的比對，實驗結果顯示，硝酸的加入可以顯著提高 Al、Ni 2 種元素的線性，以及Cu、Sn、La、Ce 的回收率（從＜60%增至＞75%），說明這幾種元素在硝酸介質中不易降解或沉淀損失，更易溶出；吡咯烷二硫代氨基甲酸銨加入可以顯著提高Sn、La、Ce的回收率（從＜40%增至＞88%），說明吡咯烷二硫代氨基甲酸銨可提高這幾種元素的溶出；乙醇的加入可使得As的回收率好轉，且能有效提高大多元素的響應值（1.1～1.5 倍）；四甲基氫氧化銨的添加會造成 Al、Cu、La、Ce 等元素回收率下降，可能是堿性條件下容易發生沉淀造成損失，對其余各元素影響甚小。綜合各元素回收率的情況，實驗終選取稀釋劑組合為：1%硝酸，0.05%TrtionX-100 溶液，0.01%吡咯二硫代氨基甲酸銨，1%乙醇。

稀釋倍數 隨機抽取10份血清樣品混合，優化的稀釋劑，在10～30倍范圍內對稀釋倍數進行了考察。由于血清粘度較大、基質較復雜，采用較低稀釋倍數時，容易堵塞進樣毛細管，對部分元素尤其是樣品中低含量的元素分析產生干擾，使其測定的精密（＞20%）和回收率較低（40%～60%），但稀釋倍數太高又會導致一些元素分析靈敏度低。綜合考慮回收率和靈敏度，實驗終選擇血 清樣品稀釋20倍，離心后進樣分析。

討論

檢測模式和樣品處理方式 實驗比較了 ICP-MS 在 2 種模式下（He模式/No Gas 模式）各種 元素的測定結果，考慮到元素的線性回歸以及加標 回收率，在者模式下各種元素有更好的結果呈現， 因此實驗選擇了在He模式下進行元素測定。這基于He模式可以有效消除多原子離子干擾，是ICP-MS測定的基本原理，在此不再贅述。 實驗重點考察了血清樣品處理方式，采用 消解法與直接稀釋法對血清樣品進行處理。與 文獻報道一致，消解法可以徹底的除去血清中的 有機基質，取得良好的回收率，但揮發性元素的揮 發損失、消解后的趕酸過程以及因趕酸不徹底帶來的酸度干擾，均會使操作更為繁瑣或降低方法的準確度。