標題免疫組化抗原熱修復的技術要點

                     1、抗原熱修復溫度和時間的關系

    我們日常工作中所使用的組織固定液福爾馬林會引起組織蛋白內或蛋白之間的亞甲基發生橋連，具體過程如下：
    第一步基本反應福爾馬林和氫反應形成新的化合物
    第二步基本反應福爾馬林和氫反應形成新的亞甲基橋
    上述反應的結果導致許多抗原決定簇被封閉，而加熱可以水解該橋連使抗原被激活。影響抗原熱修復的兩個最關鍵的因素是溫度和時間，有人將這兩種因素對抗原修復的影響總結為下面的公式：
    抗原熱修復的有效性=加熱溫度（T） × 加熱時間（t）
    也就是說當我們修復時的溫度越低則需要修復的時間就越長；反過來當修復溫度增高時修復的時間可以適當地縮短，才能使抗原決定簇完全暴露，這種反比的關系從抗體的實驗結果表1中也可以清楚地看出。
             

                        2、組織固定時間和所需的抗原熱修復的關系
    大量的實驗表明，固定時間越長的標本，它所形成的橋連就越緊密，抗原就越難以被激活，所需要的修復強度也就越強。有意思的是隨著固定時間的延長，組織中蛋白對溫度的耐受也相應增高（如圖1所示），這可能就是我們對固定時間長的標本加大修復強度的理論基礎。
圖一 固定時間和變性的關系
    這就提醒我們在做回顧性的研究時一定要注意所使用的修復條件，它與新鮮標本的修復條件一定是有所區別的，同等條件下一定要加長修復的時間或提高修復所使用的溫度，才可能得到比較滿意的結果。

                        3、不同PH值抗原修復液對染色結果的影響
    抗原熱修復中所使用的修復液PH值也會對染色結果產生相當大的影響。PH值對染色結果的影響大概可以分為以下四種情況。
    A―穩定型，PH值對染色結果影響不大，如PCNA、AE1、EMA、CD20等。
    B―V型，高PH值和低PH值染色較好，而PH值4-5染色結果較差，如ER、Ki-67等。
    C―上升型，隨著PH值的增加，染色結果逐漸增強，如HMB45等。
    D―下降型，隨著PH值的增加染色結果逐漸減弱，當然這種類型的抗體只是個別的現象，如MOC31。     一個有趣的現象值得注意，即在高PH值（圖中圓圈所示約PH8.0~9.0），A、B、C三者都有較好的染色結果，所以目前比較推崇的抗原修復液為高PH值得修復液，如1mMEDTA, PH8.0或PH9.0等。但是由于傳統習慣，絕大多數醫院和實驗室都在使用PH6.0的枸櫞酸緩沖液。綜合以上各種抗體的染色狀況，考慮到臨床工作的實際情況，許多國外免疫組化專家建議，在常規的免疫組化工作中，全部選用高PH值得修復液來代替目前廣為使用的PH6.0枸櫞酸緩沖液。為此，本公司已經推出PH8.0和PH9.0的新型抗原修復液。經驗證，絕大多數的抗體使用PH9.0得修復液效果都要優于PH6.0的枸櫞酸，尤其是核陽性的抗體。所以，在常規的免疫組化工作中，使用高PH值的抗原修復液是今后的必然趨勢。
                        4、抗原熱修復的手段
微波爐修復和高壓鍋修復的比較
                溫度    壓力   v時間    受熱
    微波爐    100℃    1P    15~20分鐘不均勻
    高壓鍋    120℃    1.2P  噴氣2分鐘 均勻
    目前抗原熱修復所采用的方法主要有微波爐修復和高壓鍋修復兩種，從表中可以看出，由于高壓鍋修復具有溫度均一、節省時間、效果穩定等特點，已經越來越受到人們的青睞。

                        石蠟切片免疫組化染色步驟
                三步法（以SP試劑盒為例）
    ●石蠟切片脫蠟至水。
    ●蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，如果采用抗原修復，可在此步后進行。
    ●3%H2O2室溫孵育5~10分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗，2分鐘×3次。
    ●5~10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小時或4℃過夜。
    ●PBS沖洗，2分鐘×3次。
    ●滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗（1%BSA-PBS稀釋），37℃孵育10~30分鐘；或滴加第二代生物素標記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~20分鐘。
    ●PBS沖洗，2分鐘×3次。
    ●滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37℃孵育10~30分鐘；或第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~20分鐘。
    ●PBS沖洗，2分鐘×3次。
    ●顯色劑顯色（DAB或AEC）。
    ●自來水充分沖洗，復染，脫水透明、封片。
    ●如果必要，可選用avdin封閉內源性生物素。

                        冰凍切片的免疫組化染色步驟
    ●速凍組織
    ●冰凍切片4~8μm，冰凍切片后如不染色，必須吹干，儲存低溫冰箱內，或進行短暫預固定后儲存于-20℃冰箱。
    ●室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘。也可根據需要選擇其他的固定方式。
    ●PBS沖洗，5分鐘×3次。
    ●用3%過氧化氫孵育5~10分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性。
    ●PBS沖洗，5分鐘×3次。
    ●下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟（滴加一抗開始）。

www.shwasw.com