標題反相高效液相色譜法檢測鯽魚肌肉中伊維菌素

【摘要】以鯽魚肌肉為材料，建立了一種簡便、準確的反相高效液相色譜法，用于魚肉中伊維菌素的藥物殘留檢測和藥代動力學研究。鯽魚肌肉中的伊維菌素用乙酸乙酯提取，離心后的上清液于45℃下氮氣吹干，殘渣用甲醇�菜�（4∶1，V/V）混合液溶解，正己烷去脂，離心后取下清液，進樣20μL進行HPLC分析。本方法考察了提取劑、柱溫和流動相的影響，確定了以乙酸乙酯為提取劑，柱溫25℃和甲醇�菜�（90∶10，V/V）為流動相的優化條件。方法線性范圍為0.025～2.50μg/g，相關系數r=0.9997，檢出限為11ng/g。批內RSD為1.0%～5.8%，日間RSD為1.0%～7.7%，相對回收率（99.8±4.1）%，絕對回收率為（95.9±3.9）%。本方法具有操作簡便，結果準確可靠的特點。
　　
　　【關鍵詞】伊維菌素，鯽魚，肌肉組織，殘留檢測，反相高效液相色譜
　　
　　1引言
　　
　　伊維菌素（ivermectin，IVM）為阿維菌素的衍生物，是目前最優秀的廣譜抗寄生蟲藥之一，具有廣譜、高效、用量小、安全等優點，對生物體內外寄生蟲，特別是線蟲和節肢動物均有高效驅殺作用。1981年投入市場后，在臨床獸醫中得到了廣泛應用。而其在水產養殖寄生蟲病害防治方面的應用也引起了人們的關注。目前，動物體內伊維菌素殘留的檢測方法主要有HPLC�睻V檢測法[1]和HPLC�矡晒鈾z測法[2,3]。但這些方法多為家畜樣品的藥物殘留檢測，對魚體內IVM的測定方法研究甚少。Pantelis等[4]利用酶聯免疫吸附測定法（ELISA法）測定了IVM在海鯛內的含量;Zhang等[5]利用液相色譜串聯質譜法測定了鰻魚體內IVM的殘留量;趙思俊等[6]采用HPLC法檢測動物肌肉中多種藥物殘留;沈金燦等[7]采用HPLC�睲S法檢測動物肌肉中獸藥殘留。這些方法各具優缺點，樣品前處理過程均較復雜，且耗時。本研究以鯽魚為實驗對象，對肌肉樣品的前處理過程進行了優化，采用反相高效液相色譜法分析了鯽魚肌肉中IVM的殘留量。研究結果可為魚體肌肉組織中IVM的殘留檢測及藥代動力學研究提供參考。
　　
　　2實驗部分
　　
　　2.1儀器與試劑
　　
　　SHIMADZU高效液相色譜儀（HPLC），配有SPD��20A紫外檢測器;SupRa22K冷凍離心機;QGC��24T氮氣吹干儀;FSH��2勻漿機;SK��2200L超聲波儀;H��101漩渦混合器。伊維菌素標準品（Sigma公司）;甲醇（色譜純，Merck公司）;乙酸乙酯（色譜純，Urchem公司）;正己烷與無水Na2SO4均為分析純（國藥公司）;水為Milli�睶超純水。
　　
　　2.2實驗方法
　　
　　2.2.1色譜條件VP�睴DSC18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）。流動相為甲醇�菜�（90∶10，V/V），流速1.0mL/min。柱溫為25℃;紫外檢測波長為245nm;進樣量20μL。
　　
　　2.2.2標準溶液的配制準確稱取50mg伊維菌素標準品于50mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得1g/L的標準儲備液。精確量取1mL標準儲備液于100mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得10mg/L的標準A溶液。精確量取標準A溶液適量，用甲醇稀釋成質量濃度分別為0.025,0.05,0.10,0.25,0.50,1.00和2.50mg/L的系列標準工作液。
　　
　　2.2.3樣品的處理稱取鯽魚肌肉組織（1.0000±0.0010）g于10mL燒杯中，剪碎后加少許無水Na2SO4和3mL乙酸乙酯，以10000r/min勻漿30s，將勻漿液倒入10mL尖底玻璃離心管A中，以3mL乙酸乙酯洗滌刀頭和小燒杯，將洗滌液全部倒入A管，超聲提取10min，以5000r/min離心8min，將上清液倒入另一支10mL尖底玻璃離心管B中，A管殘余物再用5mL乙酸乙酯提取一次，渦旋振蕩30s，超聲，離心后，合并上清液于B管中，在45℃用氮氣將B管提取液吹干后，向B管中加入1mL甲醇�菜�（4∶1，V/V）混合液，超聲5min使殘渣完全溶解，再加入1mL正己烷，渦旋振蕩30s，3000r/min離心3min，取下清液1mL，以0.22μm微孔濾膜過濾，取濾液進行RP�睭PLC檢測。
　　
　　3結果與討論
　　
　　3.1樣品處理方法的選擇和色譜分析條件的優化
　　
　　3.1.1提取劑的選擇自生物樣品中提取IVM的常用提取劑有乙腈、乙酸乙酯和甲醇。通過標準加入實驗，測得3種提取劑的平均絕對回收率分別為90.5%,95.9%和83.1%。甲醇提取的回收率最低，且提取物雜質多，對IVM峰的干擾很大。乙酸乙酯和乙腈提取IVM時，基質背景相對干凈，IVM峰兩邊基線平穩，分離效果很好。由于乙酸乙酯提取的回收率最高，且比乙腈更易以氮氣吹干，因此選用乙酸乙酯為提取劑。
　　
　　3.1.2去脂過程的處理本實驗用正己烷去脂，但正己烷與甲醇部分互溶，因此，前處理過程中，氮氣吹干后的殘渣不能直接加甲醇溶解定容。實驗發現，甲醇�菜�（4∶1，V/V）混合液能很好地溶解殘渣，且與正己烷不互溶。因此，氮氣吹干后的殘渣用甲醇�菜�（4∶1，V/V）混合液溶解定容。
　　
　　3.1.3流動相的選擇當流動相中甲醇與水的比例分別為100∶0,93∶7,91∶9和90∶10時，IVM的出峰時間分別為3.5,8.1,9.5和13.1min。實驗表明，當用甲醇�菜�（90∶10，V/V）為流動相時，IVM與雜質分離良好，基線平穩，左右無干擾峰。提高流動相中甲醇的比例會使IVM出峰時間提前，IVM還未與雜質完全分離就出峰，將導致IVM峰兩邊的基線不平，因此本實驗選用甲醇�菜�（90∶10，V/V）為流動相。
　　
　　3.1.4柱溫的選擇比較了20,25和35℃時IVM的色譜圖可見，溫度越高，IVM的保留時間越短。當用甲醇�菜�（90∶10，V/V）為流動相時，3個溫度條件下IVM的保留時間分別為14.7,13.1和10.9min。IVM的峰形變化不大，柱效值分別為3542,3797和4084。高柱溫時峰形略尖，但由于保留時間會較短，受樣品中背景基質的影響，有時會出現IVM峰兩邊基線不平的現象。綜合考慮保留時間、柱效和分離度，本實驗選用柱溫為25℃。圖1IVM的色譜圖
　　
　　3.2色譜行為
　　
　　圖1為IVM標準工作液、加標肌肉樣品及空白肌肉樣品的色譜圖。由圖1可知，在本實驗條件下，基線走動平穩，IVM的保留時間約為13min，無干擾峰出現。
　　
　　3.3標準曲線
　　
　　取質量濃度分別為0.025，0.05，0.10，0.25，0.50，1.00和2.50mg/L的IVM系列標準溶液20μL，直接進樣，進行HPLC分析，每個濃度平行測定2次，在質量濃度為0.025～2.50mg/L的范圍內，IVM色譜峰面積與其濃度具良好的線性關系，A1=39683C1-680.34，相關系數r=0.9999。
　　
　　準確稱取空白鯽魚肌肉樣品（1.0000±0.0010）g于10mL燒杯中，剪碎并向小燒杯中分別添加1mL質量濃度為0.025,0.05,0.10,0.25,0.50,1.00和2.50mg/L的系列標準工作液，避光靜置1.5h，按2.2.3項方法，每個濃度平行測定2次，在標準加入質量濃度為0.025～2.50μg/g時，肌肉樣品中IVM色譜峰面積與其濃度具良好的線性關系，A2=35538C2 274.39，相關系數r=0.9997。
　　
　　3.4精密度和回收率
　　
　　分別取含IVM0.125,0.50,2.50μg/g的3種不同質量濃度加標肌肉樣品，按2.2.3項方法，每隔一天測1次，共測3次，每個濃度平行測定5次，據此計算批內和日間精密度（RSD），結果見表1。肌肉樣品批內RSD為1.0%～5.8%;日間RSD為1.0%～7.7%。肌肉樣品的相對回收率為96.9%～101.9%;絕對回收率為91.8%～103.8%。表1鯽魚肌肉組織中IVM的回收率和精密度
　　
　　3.5方法檢出限
　　
　　根據美國EPASW��846的規定進行方法檢出限（methoddetectionlimits，MDL）的研究[8]，測定2組低濃度加標樣品（0.05μg/g），每組設7個平行樣，進行差異顯著性分析，計算標準偏差S。以公式MDL=3.143S求出方法檢出限。
　　
　　取α=0.05，經差異顯著性檢驗可知F=0.64﹤F（0.05）=4.75，兩組數據無顯著差異。計算可得S=0.003452，MDL=0.011，即本方法的檢出限為11ng/g。表2RP�睭PLC方法檢出限的測定結果
　　
　　IVM在水產養殖中的應用已很廣泛，但由于其存在較大的水生態風險，歐洲許多國家并未批準其作為漁藥使用，而目前我國尚無這方面的規定。農業部頒布的NY5029��2001和NY5044��2001二則無公害食品質量標準規定：豬肉脂肪中IVM的含量不得超過0.02mg/kg，牛肉脂肪中IVM的含量不得超過0.04mg/kg[9，10]。盡管IVM在魚肉中的最高殘留量尚無規定，鑒于目前IVM在水產養殖中的廣泛應用及食品安全的重要性，研究出一種適合檢測魚肉內IVM含量的方法已十分必需。本實驗以鯽魚為實驗對象，對肌肉樣品的前處理過程進行了優化，省去SPE柱凈化環節，然后采用RP�睭PLC紫外檢測法對其進行檢測。實驗方法簡便，回收率高，且獲得了良好的IVM色譜圖。本方法的檢出限為11ng/g，低于商檢行業標準的方法檢出限（0.015mg/kg）[11]。本方法操作簡便、快速、準確，適用于IVM在魚體內的藥代動力學研究及魚體內IVM的殘留檢測分析。