標題細胞冷凍保存法及解凍培養技巧

細胞將做冷凍保存
:第一、株化細胞產生性狀轉變（transformation）。第二、污染。第三、株化細胞之增殖或生理特性有特定之限制，只能在一定的代數范圍內進行增殖培養或進行特定實驗。目前可能解決這些困難的方法其中之一是細胞冷凍保存法，將冷凍細胞儲于冷凍管中，將其中一部分拿出來做一些必要的檢查，其它的冷凍細胞則在需要時拿出來解凍，用來進行實驗。本方法亦可節省繼代培養時所花費的勞力、物力，并可防止培養中經常發生意外事故，喪失細胞珠。因此冷凍保存法為細胞培養研究上之基本技術之一。

[說明] :
1.經過冷凍保存后的細胞，其生存率會下降，冷凍時之冷卻速度，保存溫度，解凍時升高溫度的速度以及添加之冷凍保存液之種類、濃度等都可影響細胞存活率。
2. 一般而言，４℃以下慢慢地冷凍，保存于液態氮中（-196℃）。
3. 37℃快速解凍。
4.保護劑（抗凍劑）：添加甘油 （glycerol） （ I0 %左右 ） 或dimethy1sulfoxide （DMSO） （ 5- 10% ） 。
5.有些細胞如果采用上述的方法時，無法得到高的存活率。此時，則必需考慮可能傷害細胞的機制，添加劑之作用等而來找出適當的條件來修正。

[材料] :
1.增殖期之細胞 （9成滿），培養于培養皿中數個。
2.冷凍用培養基（2倍） : 培養基內加入三倍血清及15% DMSO，保存在冰箱中。
3. 冷凍管、保利龍制容器、鋁制ample支持棒。

[步驟]:
1.準備2 x 107cells/ml的細胞懸浮液。
2.冷凍用培養基（2倍） :以微溫水溶解DMSO，在培養基中混合為15% （v/v）。這是DMSO的二倍濃度之溶液。必須在進行實驗前在行配制，配好后放在冰箱中，使用量必須和細胞懸浮液的量相等；使用時維持在4℃。
3.分裝: 在冷凍管管中分別加0.5ml （1/2冷凍管體積）冷凍用培養基（2倍）及2 x 10（7次方）cells/ml的細胞懸浮液；等量混合。將蓋子扭緊后，在管中部貼上膠帶密封。
4.記載卷標 : 用抗凍marker pen在冷凍管上寫明細胞名稱、代數、冷凍的年，月，日等所需要的項目。
5.放進冷卻的保利龍容器中，而在- 80℃的超低溫槽中放置一個晚上。
6.放進液態氮容器中及保存 : 在支持棒上裝上冷凍管，迅速地放進容器內。