標題地高辛配基隨機標記DNA探針

1．標記DNA探針　每次標準的反應可標記10ng至3μg線性的DNA，也可標記更大量的DNA，但所有的成分和體積要相應增加。
　�。�1）DNA探針熱變性，煮沸10min，迅速冷卻于冰/乙醇中5min以上，待用。
　�。�2）取Eppendorf管（1.5ml）置于冰上，加下列及試劑：
　　新鮮變性的DNA 　　　　　　　　　1-3μg
　　六聚核苷酸混合物 　　　　　　　　2μl（管5）
　　dNTP標記用混合底物 　　　　　　　2μl（管6）
　　加無菌重蒸水至　　　　　　　　　 19μl
　　DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow）　　　1μl（管7）
　�。�3）在37℃保溫至少60min，可到20h。
　�。�4）煮沸5min，終止反應。
　�。�5）15000rpm離心30s，置于冰上待用。

　　2．預雜交　按100cm2膜用20～40ml預雜交溶液，預雜交時使溶液處于流動狀態。
　　預雜交液組成：5×SSC
　　0.5%（W/V）封阻試劑（管11）
　　0.1%（W/V）N-十二烷酰肌氨酸鈉
　　0.02%（W/V）SDS
　　膜放入塑料袋，灌入預雜交液，排除氣體后密封，在65℃預雜交過夜。

　　3．雜交　按100cm2膜用2.5ml雜交液，雜交時偶爾搖動雜交袋，使里面的溶液重新分配。
　　雜交液組成： 50%甲酰胺（V/V）
　　5%（W/V）封阻試劑
　　5×SSC
　　0.1（W/V）N-十二烷酰肌氨酸鈉
　　0．02%（W/V）SDS
　　新變性標記DNA（150ng/ml）

　　雜交液取代預雜交液，替換間膜不能干，成功地替換應是膜與塑料袋間形成一層雜交液膜。于42℃雜交過夜（16～20h）。

　　4．洗膜　　按100cm2膜用250ml洗膜液計算。
　�。�1）在室溫下用2×SSC/0.1%（W/V）SDS溶液漂洗，5min，2次。
　�。�2）在65℃條件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗，10min，2次。
　�。�3）在室溫下用2×SSC溶液漂洗1次。

　　5．免疫測定

　�。�1）配制溶液
　　緩沖液1：Tris-HCl（100mmol/L）;NaCl（150mmol/L）pH7.5（20℃）
　　緩沖液2：0.5%（W/V）封阻試劑（管11）,配制于緩沖液1中（封阻試劑不會快速溶解,因此應預早1h前配制此溶液,將試劑溶于50～70℃,此溶液保持混濁）。
　　緩沖液3：Tris-HCI（100mmol/L）;NaCI（100mmol/L）;MgCI2（500mmol/L）pH9.5（20℃）。
　　緩沖液4：Tris-HCl（10mmol/l）;EDTA（1mmol/L）;pH8.0（20℃）
　　顯色溶液：新鮮配制，在10ml緩沖液3中，加45μlNBT溶液（管9）和35μlX-磷酸鹽緩沖液（管10）。

　　2． 顯色過程
　　A．膜在緩沖液1中短暫洗滌（1min）。
　　B．在100ml緩沖2中保溫30min。
　　C．再用緩沖液1短暫洗滌。
　　D.用緩沖液1稀釋的抗體結合物（管8）至150U/L（1:5000）;稀釋后的抗體結合物在4℃只能穩定12h。
　　E.膜在20ml稀釋的抗體結合物溶液中保溫30min。
　　F.用100ml緩沖液1洗膜,以除去未結合的抗體結合物,15min,2次。
　　G.膜在緩沖液3中平衡2min。
　　H.在黑暗條件下,膜與10ml顯色溶液放入塑料袋內密封或放入合適的盒子內,幾分鐘內開始出現顏色,一般顯色反應在1天后全部完成。當顏色顯影時，不可振蕩或攪拌。
　　I．當要求的點或帶已被檢測時，可用50ml緩沖液4洗膜5min終止反應。
　　J．攝相。
　　說明：上述各反應均在室溫下進行，除了顯色反應外，均需振蕩或攪拌。

　�。ㄎ澹┡懦龑嶒炛袉栴}的方法

　　1．DNA不能有效地被標記時考慮
　�。�1）用酚/氯仿抽提和/或乙醇沉淀，重新純化DNA。
　�。�2）標記反應的保溫時間延長（增至20h）。
　�。�3）DNA變性或許不完全，這時對大片段DNA特別重要。

　　2．不能達到預期的靈敏度時考慮
　�。�1）DNA標記率。
　�。�2）增加標記DNA的濃度或增加雜交時間。
　�。�3）顯色反應的時間可延長至3d。

　　3．若顯色時背景過深，可采取
　�。�1）在雜交溶液中減少標記DNA量。
　�。�2）增加雜交溶液的體積，使膜隨意漂浮在溶液中。
　�。�3）某些類型的尼龍膜可能產生深色背景，因此可采用其它類型的尼龍膜或改用硝酸纖維素膜。
　�。�4）在雜交和檢測過程中增加封阻試劑的濃度。