標題重慶道地藥材青蒿高效液相色譜指紋圖譜研究

  【摘要】目的建立重慶道地藥材青蒿高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜研究方法。方法采用反相高效液相色譜法，測定青蒿藥材指紋圖譜，色譜條件為：色譜柱：ShimadzuC18（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-水梯度洗脫；流速：1.0ml·min-1；檢測波長：206nm；柱溫：25℃。結果建立了重慶道地藥材青蒿指紋圖譜標準。結論該指紋圖譜方法簡便、快速、重現性好，可作為青蒿藥材的一項質控指標。
　　
　　【關鍵詞】青蒿指紋圖譜模糊模式識別高效液相色譜
　　
　　Abstract：ObjectiveToestablishanHPLCfingerprintanalysismethodforidentificationofArtemisiaannuaL.fromChongqing.MethodsThefingerprintwasdeterminedbyHPLC.TheanalysiswascarriedoutonShimadzuC18column（150mm×4.6mm,5μm）.ThemobilephasewasCH3OH-H2O（gradientelution）withaflowrateof1.0ml·min-1at206nmandtheseperationwasperformedat25℃．ResultsThestandardoffingerprintinArtemisiaannuaLwasestablished.ConclusionThemethodissimple,fastandrepeatable.ItcanbeusedinqualityassessmentofArtemisiaannuaL.
　　
　　Keywords：ArtemisiaannuaL；Fingerprint；Fuzzypatternrecognition；HPLC
　　
　　青蒿為菊科植物黃花蒿ArtemisiaannuaL.的地上部分,味苦、微辛，性寒。具有清熱、解暑作用。用于瘟病、暑熱、骨蒸勞熱、瘧疾、痢疾、瘡癢等［1］。生于曠野、山坡、河岸，分布于全國各地，是重慶道地藥材之一。本實驗利用HPLC法建立了以青蒿素為參照峰的重慶道地藥材指紋圖譜，利用模糊模式識別軟件計算各批藥材相似度，為建立符合規�；�生產的青蒿藥材基地提供更多的科學依據。
　　
　　1儀器與試藥
　　
　　Waters液相色譜儀（Waters1525泵、Waters2487紫外檢測器）；SK2200LH超聲儀（昆山市超聲儀器公司）；H·S·G-IIC-4電熱恒溫水浴鍋（上海儀表供銷公司）；METTLERAE240電子分析天平。
　　
　　甲醇（色譜純）；乙醇（藥用）；其他試劑均為市售分析純；水為純凈水，青蒿素對照品（批號0202-9501，供含量測定用）由中國生物制品檢定所提供。
　　
　　共收集青蒿藥材樣品15批，均為重慶酉陽栽培品種，經本校傅善權副教授鑒定為黃花蒿ArtemisiaannuaL.的地上部分。
　　
　　2方法與結果
　　
　　2.1對照品溶液的制備取青蒿素對照品適量，用甲醇溶解制成1.10mg·ml-1的對照溶液，作為參照物。
　　
　　2.2供試品溶液的制備稱取青蒿藥材10g，加50ml乙醇回流提取3h，濾過，再加25ml乙醇同法處理兩次，濾過，合并濾液，減壓濃縮至無乙醇，加入相同體積的醋酸乙酯萃取3次，合并萃取液，濃縮至干，各取一定量，制成2.5mg·ml-1的溶液，0.45μm濾膜濾過，作為供試品溶液。
　　
　　2.3色譜條件參考文獻［2，3］并經篩選確定其色譜條件為色譜柱：ShimadzuC18（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇（A）-水（B）梯度洗脫（見表1）；流速：1.0ml·min-1；檢測波長206nm；柱溫：25℃，青蒿色譜圖見圖1。
　　
　　表1流動相梯度洗脫程序（略）
　　
　　圖1青蒿素參照物與青蒿藥材HPLC圖（略）
　　
　　2.4方法學考察與結果
　　
　　2.4.1穩定性實驗取“2.2”項供試樣品溶液，在上述色譜條件下，分別于0，2，4，8，16h進樣10μl，記錄指紋圖譜。各共有峰的保留時間的RSD為1.08%～2.71%，百分面積RSD為1.15%～2.82%，百分高度RSD為1.13%～2.94%，符合中藥指紋圖譜研究的技術要求，結果表明樣品溶液在16h內穩定。
　　
　　2.4.2精密度實驗取“2.2”項供試樣品溶液，在上述色譜條件下，連續進樣5次，記錄指紋圖譜。結果表明，各共有峰的保留時間的RSD為1.51%～2.91%，百分面積的RSD為1.94%～2.89%，百分高度的RSD為1.47%～2.98%，符合中藥指紋圖譜研究的技術要求，表明該儀器精密度較好。
　　
　　2.4.3重現性實驗取供試樣品6份，按“2.2”項供試樣品溶液制備方法制得供試樣品溶液。在上述色譜條件下，分別進樣10μl，記錄指紋圖譜。結果表明，各共有峰的保留時間RSD為1.23%～2.82%，百分面積RSD為1.02%～2.78%，百分高度RSD為0.98％～2.97％，符合中藥指紋圖譜研究的技術要求，表明樣品重復性較好。
　　
　　2.4.4青蒿樣品指紋圖譜模式標準的建立分別取10批不同批號的青蒿藥材，按供試品制備方法制備，在上述色譜條件下各進樣10μl，記錄色譜圖。經比較10批樣品的色譜圖，其中有11個峰為共有指紋峰。選擇相對保留時間、相對峰面積、相對峰高為特征參數，計算各特征參數平均值，建立指紋圖譜模式標準，見表2。
　　
　　表210批青蒿藥材指紋圖譜模式標準（略）
　　
　　2.4.5樣品測定與相似度計算取5批樣品,在相同色譜條件下測定，采用廣義夾角余弦［4］，計算樣品各共有色譜峰與標準模式中對應的色譜峰的相似度。結果各指紋圖譜的相似度均大于0.9，即各批樣品與所建立的模式標準有較好的相似性（見表3）。
　　
　　3討論
　　
　　本實驗對供試品溶液的制備方法、色譜條件進行了篩選。通過對不同提取溶劑、提取方法進行比較，以文中供試品的制備方法，所得指紋圖譜峰數較多。以甲醇-水梯度洗脫分離效果較好，能使樣品中各色譜峰較好地分離且出峰較多。對青蒿素的測定，大多采用衍生化方法，本文采用190～400nm波長掃描確定其最大吸收波長為206nm，避免了衍生化方法的繁瑣，使樣品處理更方便、快捷。
　　
　　采用相對保留時間、相對峰面積、相對峰高等定量表征參數對指紋圖譜進行分析，以10批不同批次藥材制定了青蒿藥材指紋圖譜模式標準。在此基礎上，采用模糊模式識別方法評價5批樣品各共有峰的相似度均大于0.9，符合中藥指紋圖譜研究的技術要求。
　　
　　表35批樣品相似度計算結果（略）
　　
　　該方法具有穩定、重復性好的特點，是一種理想的指紋圖譜分析方法，可作為青蒿藥材的質控指標。