標題金黃色葡萄球菌檢驗

 【GB/T 4789.10?1994】
食品衛生微生物學檢驗　金黃色葡萄球菌檢驗

　　1　主題內容與適用范圍
　　本標準規定了食品中金黃色葡萄球菌的檢驗方法。
　　本標準適用于食品和食物中毒樣品中金黃色葡萄球菌的檢驗。
　　2　引用標準
　　GB 4789.28　食品衛生微生物學檢驗染色法、培養基和試劑
　　3　設備和材料
　　3.1　顯微鏡。
　　3.2　溫箱：36±1℃。
　　3.3　離心機。
　　3.4　滅菌吸管：1mL、10mL。
　　3.5　滅菌試管。
　　3.6　滅菌平皿。
　　3.7　均質器。
　　3.8　載玻片。
　　3.9　L型涂布棒。
　　3.10　酒精燈。
　　3.11　接種環。
　　4　培養基和試劑
　　4.1　胰酪陳大豆肉湯：按GB 4789.28中4.59規定。
　　4.2　7.5%氯化鈉肉湯：按GB 4789.28中4.61規定。
　　4.3　血瓊脂平板：按GB 4789.28中4.6規定。
　　4.4　Baird－Prker瓊脂平板：按GB 4789.28中4.60規定。
　　4.5　肉浸液肉湯：按GB 4789.28中4.1規定。
　　4.6　滅菌鹽水。
　　4.7　兔血漿：按GB 4789.28中4.63規定。
　　5　檢驗程序
　　金黃色葡萄球菌檢驗程序如下：
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　　6　操作步驟
　　6.1　增菌培養法
　　6.1.1　檢樣處理
　　稱取25g固體樣品；吸取25mL液體樣品，加入225mL滅菌生理鹽水，固體樣品研磨或置均質器中制成混懸液。
　　6.1.2　增菌及分離培養
　　吸取5mL上述混懸液，接種于7.5%氯化鈉肉湯或胰酪陳大豆肉湯50mL培養基內，置36±1℃溫箱培養24h，轉種血平板和Baird－Parker平板，36±1℃培養24h，挑取金黃色葡萄球菌菌落進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。
　　6.1.3　形態
　　本菌為革蘭氏陽性球菌，排列是葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，致病性葡萄球菌菌體較小，直徑約為0.5～1μm。
　　6.1.4　在肉湯中呈混濁生長，在胰酪陳大豆肉湯內有時液體澄清，菌量多時呈混濁生長，血平板上菌落呈金黃色，也有時為白色，大而突起、圓形、不透明、表面光滑，周圍有溶血圈。在Baird－Parker平板上為圓形、光滑凸起、濕潤、直徑為2～3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。
　　6.1.5　血漿凝固酶試驗
　　吸取1∶4新鮮兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入培養24h的金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯培養物0.5mL，振蕩搖勻，放36±1℃溫箱或水浴內，每半小時觀察一次，觀察6h，如呈現凝固，即將試管傾斜或倒置時，呈現凝塊者，被認為陽性結果。同時以已知陽性和陰性葡萄球菌株及肉湯作為對照。
　　6.2　直接計數方法
　　6.2.1　吸取上述1：10混懸液，進行十倍遞次稀釋，根據樣品污染情況，選擇不同濃度的稀釋液1mL，分別加入三塊Baird－Parker平板，每個平板接種量分別為0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用滅菌L棒涂布整個平板。如水分不多吸收，可將平板放在36±1℃溫箱1h，等水分蒸發后反轉平皿置36±1℃溫箱培養。
　　6.2.2　在三個平板上點數周圍有混濁帶的黑色菌落，并從中任選5個菌落，分別接種血平板，36±1℃24h培養后進行染色鏡檢、血漿凝固酶試驗，步驟同增菌培養法。
　　6.2.3　菌落計數：將三個平板中疑似金黃色葡萄球菌黑色菌落數相加，乘以血漿凝固酶陽性數，除以5，再乘以稀釋倍數，即可求出每克樣品中金黃色葡萄球菌數。
　　
　　　　　　　　　　　　　　　　附錄A
　　　　　　　　　　　　葡萄球菌腸毒素檢驗
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　　A1　設備和材料
　　A1.1　均質器。
　　A1.2　冰箱。
　　A1.3　離心機。
　　A1.4　分液漏斗。
　　A1.5　透析袋。
　　A1.6　振蕩培養箱或普通溫箱：36±1℃。
　　A1.7　滅菌吸管：1mL、10mL。
　　A1.8　電線。
　　A1.9　載玻片。
　　A1.10　三角瓶：250mL。
　　A1.11　直徑150mm大平皿（或帶蓋搪瓷盤）。
　　A1.12　玻璃紙。
　　A1.13　鑷子。
　　A1.14　三角棒。
　　A1.15　直徑2.5mm打孔器。
　　A1.16　有機玻璃模板。
　　A1.17　橡皮圈。
　　A1.18　細滴管。
　　A1.19　層析柱：40mm×20～25mm。
　　A1.20　酶標測定器。
　　A1.21　洗瓶。
　　A1.22　微量加樣器：200mL、50mL。
　　A2　培養基和試劑
　　A2.1　腸毒素產毒培養基：按GB 4789.28中4.87規定。
　　A2.2　營養瓊脂。
　　A2.3　1%瓊脂糖（0.9%生理鹽水配制）溶液。
　　A2.4　0.2mol/L pH7.5磷酸鹽緩沖液。
　　A2.5　三氯甲烷。
　　A2.6　6mol/L鹽酸溶液。
　　A2.7　5mol/L氫氧化鈉。
　　A2.8　生理鹽水。
　　A2.9　1%乙酸溶液。
　　A2.10　0.1%噻嗪紅R或氨基黑B。
　　A2.11　硅膠或凡士林。
　　A2.12　A、B、C、D型葡萄球菌腸毒素和抗血清。
　　A2.13　羧甲基纖維素（CM22或CM11 Whatman）。
　　A2.14　0.008mol/L pH5.6磷酸鹽緩沖液。
　　A2.15　0.008mol/L pH6.8磷酸鹽緩沖液。
　　A2.16　酶標記A、B、C、D腸毒素抗血清或酶聯免疫試劑盒。
　　A2.17　0.1mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液。
　　A2.18　0.05%0.02mol/L pH7.2吐溫－20緩沖液。
　　A2.19　鄰苯二胺酶底物。
　　A2.20　2 mol/L硫酸。
　　A3　檢驗程序
　　A3.1　從菌株中檢測腸毒素
　　從菌株中檢測腸毒素程序見圖A1：
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　　A3.2　從食物檢樣中提取和檢測腸毒素
　　A3.2.1　微玻片法檢測腸毒素（濃縮法層析法）程序見圖A2：
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　　A3.2.2　酶聯免疫法檢測腸毒素程序見圖A3：
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　　A4　腸毒素檢測
　　A4.1　從菌株中提取腸毒素方法
　　A4.1.1　液體透析培養法：用寬2.5cm、長80cm的透析袋裝入60mL產毒培養基，兩端扎緊，將透析袋裝入250mL三角瓶內，加入15mL滅菌生理鹽水，透析袋兩端留在瓶口，用棉塞塞好，121℃高壓滅菌30min，待測的菌株接種營養瓊脂斜面（試管18mm×180mm），37C培養24h，用生理鹽水5mL，洗下菌落，傾入上述培養瓶中，每個菌種種一瓶，37℃振蕩培養48h，振速為100次/min。吸出菌液離心，8000r/min
30min，取上清液做雙相瓊脂擴散，如為陰性，再裝入透析袋內，用電風扇吹，或用多聚乙二醇，濃縮至1～2mL，再做瓊脂擴散。
　　A4.1.2　固體透析培養法：向直徑150mm的滅菌平皿或帶蓋搪瓷盤中傾入滅菌產毒培養基約100～120mL，凝固后表面鋪一滅菌玻璃紙，待測菌株接種在營養瓊脂上，37℃培養24h，用約3mL滅菌鹽水洗下菌苔，傾在玻璃紙上，用滅菌三角棒涂滿平皿，37℃培養48h，加入10～20mL滅菌生理鹽水，用滅菌三角棒刮取菌苔，吸取菌液離心，以下步驟同液體透析培養法。
　　A4.2　從食品中提取腸毒素方法
　　A4.2.1　直接濃縮法：取食品樣品100g，加入無菌0.2mo1/L
pH7.5磷酸鹽緩沖液，均質成勻漿，置4℃浸泡18～24h，用紗布過濾將濾液離心8000r/min20min，取上清液，放入分液漏斗中，加入10mL三氯甲烷，振搖10min，靜置，將底層三氯甲烷棄去（如不分層，可8000r/min離心20min）。加入6mol/L鹽酸溶液調pH至4.5，8000r/min離心20min，取上液，加5mol/L氫氧化鈉溶液，調pH至7.5，離心取上清液，裝入透析袋或玻璃紙，用電扇吹干，或放多聚乙二醇上濃縮至1～2mL，做微玻片雙向瓊脂擴散。
　　A4.2.2　層析法：如需提取較純腸毒素，可將上述濃縮液用蒸餾水洗下，裝入透析袋，以0.008mol/LpH5.6磷酸鹽緩沖液平衡，加入CM層析柱內，流速1～2mL/min，用0.008mol/L
pH5.6磷酸鹽緩沖液洗脫，再用0.2mol/LpH6.8磷酸鹽緩沖液洗脫出腸毒素。洗脫液裝入透析袋內，用電扇或多聚乙二醇濃縮至1mL，做微玻片雙向瓊脂擴散，檢測腸毒素。
　　A4.3　雙向瓊脂擴散檢測腸毒素
　　A4.3.1　微玻片法：將在95%乙醇中浸泡的載片用潔凈紗布擦干，吸取溶化的0.2%瓊脂糖（蒸餾水配制）滴在載玻片上，使剩余的瓊脂糖流下，放無塵的環境中干燥，先將一層薄塑料板放在載玻片上，然后將帶孔的有機玻璃模板邊緣涂一層薄的硅膠或凡士林，放在塑料板上，兩邊用橡皮圈系緊固定，吸取1%瓊脂糖，立即從模板中間孔加入載玻片和模板之間，直至充滿瓊脂糖，凝固后再將孔中瓊脂糖用注射器針頭挑去，在中間孔滴加抗血清，四周滴加菌株產毒液或食品提取液，放入加有濕棉球的容器內，放25～30℃18～24h觀察結果�？稍跓艄馍�，并對著暗的背景觀察，在抗血清和提取液之間呈現明顯沉淀線。如沉淀線只能微弱可見時，可進行染色。
　　A4.3.2　玻片法：吸取溶化的1%瓊脂糖2.5mL，鋪在潔凈載玻片上，凝固后用直徑2.5mm的金屬打孔器打成幅射型，孔距為2.5mm，中心孔加入腸毒素抗血清，周圍六個孔加入菌株或食品的腸毒素提取液，放入有滴加2/10000三氮化鈉濕棉球的容器內，以保持濕度。置25～30℃18～20h，觀察結果，在抗血清的提取物之間有明顯沉淀線即為陽性。
　　A4.3.3　染色法：用微玻片法取下膠帶和有機玻璃模板，玻片法可直接將玻片放入蒸餾水中浸泡4～8h，中間換2～3次水，在下述各液中浸10min，10%乙酸中含1%噻嗪紅R（或氨基黑）；1%乙酸；1%乙酸含1%甘油，如脫色不凈，可繼續浸泡。取出后蓋一濾紙，吸去多余液體，在室溫或35℃烘干。陽性者沉淀被染料顏色，可長期保存。
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　　A4.4　酶聯免疫法檢測腸毒素（雙抗體法）
　　A4.4.1　包被抗體：用0.1mol/LpH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋腸毒素抗血清使成5μg/mL，加入洗凈的苯乙烯凹孔板內，每孔0.2mL，置36±1℃30min，棄去上液。
　　A4.4.2　洗滌：用0.05%0.02mol/LpH7.2吐溫－20緩沖液洗滌5次。
　　A4.4.3　加入檢樣：如為液體，可直接加入0.2mL，固體樣品取100g，加入0.2mol/LpH7.5磷酸鹽緩沖液100mL，均質后取過濾液0.2mL。
　　A4.4.4　洗滌：同A4.4.2。
　　A4.4.5　每孔內加入酶抗體0.2mL，置36±1℃30min，同時做陽性和陰性對照。棄去上液。
　　A4.4.6　洗滌：同A4.4.2。
　　A4.4.7　每孔內加入鄰苯二胺酶底物溶液0.2mL，室溫放置30min。
　　A4.4.8　每孔內加入2mol/L硫酸0.05mL，立即放酶標儀比色。
　　A4.4.9　結果判定：樣品OD值比陰性對照，比值大于2為陽性，小于2為陰性。
　　附加說明：
　　本標準由衛生部衛生監督司提出。
　　本標準由北京市衛生防疫站負責起草。
　　本標準主要起草人劉以賢。
　　本標準由衛生部委托技術歸口單位衛生部食品衛生監督檢驗所負責解釋。