[器材和試劑]
● MicroAmp反應管 （Perkin Elmer）
● 洗脫緩沖液（20mmol/L Tris—Cl pH8．5， 2mmol/LEDTA，1％Triton X—100）
● Gene Amp9600 PCR儀（Perkin Elmer）
● 正向引物： 5’—AGAGATTACGCCAAGCC—3’（7．5pmol）
● 反向引物： 5’—TCCCAGTCACGACGT—3’（7．5pmol）
● dNTP
● NP—40 （Nonidet P—40）
● Tag緩沖液（50mmol/LKCl，10mmol/L Tris—Cl pH 8．3， 1．5mmoI/L MgCl2， 0，01％明膠）
● Ampi-Taq DNA聚合酶（Perkin Elmer）
● LB—瓊脂培養基+Amp板[LB—瓊脂培養基，50ug/ml Amp）
● Sephacril S—300（Amersham Biosciences）
● Silent MonitorM膜底微孔板（Model SMl20LP， 1．2um Loprodyne； Pall Bio Support）
● 真空過濾器（mod．EVENT 4160，Ep— pendorf）
[方法]
1．用無菌塑料吸嘴挑取一個AmpR噬菌粒菌落（直徑大約lmm）并將其轉入到0．2ml MicroAmp反應管中， 內含20u1洗脫緩沖液。在GeneAmp9600 PCR儀中，95℃加熱樣本10分鐘（避免用離心澄清，因為加熱可使細胞碎片黏附在管底）。
2．將菌落提取物作為該克隆的主拷貝保存。另外，這些菌落也可以直接轉移到PCR反應體系中，并在PCR程序中插入加熱步驟。此時，可將克隆主拷貝穿刺接種到在用UV滅菌并鋪有LB—瓊脂培養基+Amp的微板孔中。
3．配置PCR反應體系：將3ul菌落提取物加入到一個0．2ml MicroAmpTM反應管中；反應管包含150nmol/L正鏈引物和反鏈引物、50mmol/L dNTP、0．5％NP-40、Taq緩沖液和1ul AmpllTag DNA聚合酶，終體積為50ul。按以下程序運行PCR反應：94℃10秒、60℃10秒、72℃10秒，共循環30次。
4．在SilentMonitor膜底微板的各孔中，裝入Sephacril“S-300的水性懸液，使每孔中含有400ul穩定床體積介質。用真空過濾器在板底形成真空狀態，
5．吸取各個克隆PCR擴增產物并加入到含有已抽干的Sephacril孔中。真空抽吸收集96孔板中的濾液（PCR擴增模板的大小決定了采用何種凝膠過濾介質：我們發現，Sephacril S-300對分離我們的300bpPCR擴增片段效果最佳。按照上述流程，無論樣本的處理或收集均比使用商業供應的裝入微量離心管的旋轉柱更加容易和快速，還節省材料成本）。
6．用已純化的PCR產物，按照標準實驗方案進行測序。
