標題UL-1000超微量可見分光光度計測RNA質量檢測應用方案

UL-1000超微量可見分光光度計測RNA質量檢測應用方案

簡介

核糖核酸(縮寫為RNA，即RibonucleicAcid)，存在于生物細胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體。RNA由核糖核苷酸經磷酸二酯鍵縮合而成長鏈狀分子。一個核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和堿基構成。RNA的堿基主要有4種，即A腺嘌呤、G鳥嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶，其中，U(尿嘧啶)取代了DNA中的T。

原理細胞中的RNA可以分為信使RNA、轉運RNA和核糖體RNA三大類，不同組織總RNA提取的實質就是將細胞裂解，釋放出RNA，并通過不同方式去除蛋白，DNA等雜質，終獲得高純度RNA產物的過程。

儀器及試劑

美析UL-1000超微量可見分光光度計

離心管 離心機 電泳槽 凝膠板

細胞樣品
RNA提取試劑盒 熒光定量PCR Mix TRIZOL dNTP 氯仿 逆轉錄酶MMLV 異丙醇 Taq酶 DEPC水 ddH2O TE MgCl2 瓊脂糖 溴化乙錠 MOPS 甲醛 乙酸鈉 EDTA EB 溴酚蘭
樣品RNA的抽提
 1.  取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。
 2.  兩相分離 每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12 000 rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
 3.  RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12 000 rpm 離心10分鐘。此時離心不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。
 4.  RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀�；靹蚝�，4℃下7 000 rpm離心5分鐘。
 5.  RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
 6.  溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水4 0ul用槍反復吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。
RNA質量檢測
1.紫外吸收法測定
 先用稀釋用的TE溶液將紫外分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液濃度和純度。
 （1）濃度測定
 A260下讀值為1表示40 ug RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A260 x 稀釋倍數 x 40 ug/ml。具體計算如下：

 RNA溶于40 ul DEPC水中，取5 ul，1:100稀釋至495 ul的TE中，測得A260 = 0.21

 RNA 濃度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul

 取5 ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 ul，剩余RNA總量為：

 35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug

 （2）純度檢測
 RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。
 2.  變性瓊脂糖凝膠電泳測定
 （1）制膠
 1g瓊脂糖溶于72 ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10 x MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10x MOPS電泳緩沖液

濃度     成分

0.4 M  MOPS，pH 7.0

0.1 M  乙酸鈉

0.01 M  EDTA
 灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的1xMOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。

 （2）準備RNA樣品
 取3 ugRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10 ug/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

 （3）電泳
 上樣凝膠須預電泳5 min，隨后將樣品加入上樣孔。5-6 V/cm電壓下2 h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2-3 cm。
 （4）紫外透射光下觀察并拍照
 28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶，RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。

結果計算

RNA得率有很強的組織特異性，不同組織RNA的豐度和RNA提取的易難程度共同決定了該種組織的RNA得率。一般來說，可通過分光光度計測定RNA溶液在260nm處的吸光值來計算RNA的含量。RNA溶液在260、320、230、280nm下的吸光度分別代表了核酸、溶液渾濁度、雜質濃度和蛋白等有機物的吸收值。用標準樣品測得在波長260nm處，1ug/mlRNA鈉吸光度0.025（光程為1cm），即OD260=1時，樣品中RNA濃度為40ug/ml。通常分光光度計OD260的讀數要介于0.15-1.0之間才是可靠的。因此RNA提取結束后，要根據大概產量稀釋到適當濃度范圍，再用分光光度計檢測。按下面的共識計算總RNA濃度：

總RNA濃度（ug/ml）=OD260×稀釋倍數×40ug/ml