標題DNA核酸濃度的測定實驗應用方案（超微量紫外分光法）

引言

寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA可以定量溶于緩沖液，構成核酸的嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵，使核苷核和核酸在紫外線光具有特征性的吸收光譜，大吸收峰為260nm。窄光帶紫外分光光度計，長260nm．，比色杯光徑1cm，1個吸光度值（1A）相當于50ug/ml雙螺DNA，40ug/ml單螺旋DNA或RNA），20 ug/ml寡核苷酸。

測試，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液。然而，實驗并非帆風順。讀數不穩定可能是實驗者頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現出的吸光值漂移越大。

原理

紫外分光光度法基于DNA鏈上堿基的苯環結構在紫光區具有較強吸收，DNA/RNA在260nm處有大的吸收峰，蛋白質在28Onm處有大的吸收峰，鹽和小分子則集中在230nm處。因此，可以用260nm波長進行分光測定核酸濃度，OD值為1相當于大約50ug/ml雙鏈 DNA，單鏈DNA濃度約為33ug l ml，RNA約為40ug/ml，寡核苷酸約為35ug/ml。如用1cm光徑，用 H,O稀釋DNA/RNA樣品n倍并以H,O為空白對照，根據此時讀出的OD260值即可計算出樣品稀釋的濃度:

DNA (mg/ml ) =50×OD260 讀數×稀釋倍數/1000RNA (mg/ml) =40×OD260讀數×稀釋倍數/1000。

A280nm是蛋白和酚類物質高吸收峰的吸收波長，比值可進行核酸樣品純度評估:純DNA的A260/A280比值為1.8，純RNA為2.0。假如比值低，表示受到蛋白（芳香族)或分類物質的污染，需要純化樣品。比值=1.5相當于50%蛋白質/DNA溶液。A230nm是碳水化合物高吸收峰的吸收波長，比值可進行核酸樣品純度評估:純DNA和RNA的A260/A230比值為2.5。若比值小于2.0標明樣品被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機溶劑污染，需要純化樣品。

A320nm或A340nm為檢測溶液樣品的濁度，該值應該接近0.0。假如不足，標明溶液中有懸浮物，需要純化樣品。

儀器及試劑

UL-1000超微量紫外可見分光光度計

比色杯

樣本DNA

雙蒸水

測定

1、將制備的DNA懸浮溶解于TE緩沖液中 pH8.0，10mmo1L的Tris緩沖液，內含(1mmol/L EDTA)或懸浮溶解在滅菌水中(依據DNA含量加水)。

2、用可掃描的紫外分光光度計測定制備的DNA/RNA的紫外吸收曲線，測定OD260和OD280，并計算比值:OD260/OD280，純 DNA的此比值約為1.8~2.0。純RNA的此比值

約為大于2.0。

3、根據每毫升1微克的純DNA的OD260值=0.020，計算所得 DNA的純度:每毫升1微克的純RNA的OD260值=0.025，計算所得RNA的純度。

注意事項

OD值范圍應該在0.1~0.99之間，否則不符合上述線性關系。

A260/A280比值可提供DNA純度的個參考，但A260/A280比值會受pH影響。如果未調pH，比值可能與實際近期將陸續推出批全新的分析類儀器。差別很大。如果需要準確數值，建議在10 mM Tris Cl，pH 8.5中檢測，此時純凈的 DNA A260/A280比值應為1.8-2.0（注意應使用同樣緩沖液作為對照)

在測試時，離子濃度太高，也會導致讀數漂移，因此建議使用pH值定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了大程度減少顆粒對測試結果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值好在0.1-1.5A。在此范圍內，顆粒的干擾相對較小，結果穩定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試范圍）。后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現負值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數和樣品濃度單位選擇致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達到比色杯要求的小體積等多個操作事項。

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