標題淋巴細胞轉化實驗

T淋巴細胞表面具有植物血凝素（PHA）和刀豆蛋白（ConA）等非特異性有絲分裂原受體,在體內或體外遇到有絲分裂原刺激后,可轉化為淋巴母細胞,依其細胞轉化程度可測定T細胞的應答功能,稱為淋巴細胞轉化試驗.
[實驗原理]
T淋巴細胞表面具有植物血凝素（PHA）和刀豆蛋白（ConA）等非特異性有絲分裂原受體,在體內或體外遇到有絲分裂原刺激后,可轉化為淋巴母細胞,依其細胞轉化程度可測定T細胞的應答功能,稱為淋巴細胞轉化試驗.
淋巴母細胞的主要特點：
（1）形態學改變:細胞體積明顯增大,為成熟淋巴細胞3-4倍.核膜清晰,核染色質疏松呈網狀.核內見明顯核仁1-4個.胞漿豐富,嗜堿性,有偽足樣突出.胞漿內有時可見小空泡.
（2）細胞內核酸和蛋白質合成增加.
（3）細胞代謝功能旺盛.
利用淋巴母細胞的不同特點,目前有多種實驗方法可用于淋巴細胞轉化程度的檢測.根據其形態學改變,可通過體內法和體外法檢測；根據細胞內核酸和蛋白質合成增加的特點,可通過 3 H-TdR 摻入法檢測；根據細胞代謝功能旺盛的特點,可通過MTT法進行檢測.
一、淋轉試驗形態學檢查法（體內法）
[實驗原理]
在體內,當外周血T淋巴細胞遇到PHA 或ConA后可發生轉化形成淋巴母細胞,通過采集外周血涂片染色,鏡下計數100-200個淋巴細胞,計算其轉化率.轉化率高低可反映機體細胞免疫水平, 因此常作為檢測細胞免疫功能的指標之一.形態學方法簡便易行,但結果受操作和主觀因素影響較大.
[實驗材料]
1. ConA 溶液：根據ConA的純度配制成最適濃度,一般為0.3-0.5mg/ml.
2.姬姆薩染液或瑞氏染液.
3.玻片、離心機、顯微鏡、計數器等.
[實驗方法]
1.實驗前3天,每只小鼠腹腔注射ConA0.3-0.5毫克.
2.3天后,通過摘除小鼠眼球采集外周血,加入預先加有肝素的試管中.
3.涂片:取1小滴抗凝血滴在玻片中央,用推片將血液涂開.自然干燥.
4.固定:取甲醇1-2滴滴在涂片上,自然干燥.
5.染色:加姬姆薩或瑞氏染液2滴于涂片上,同時加2滴水,用吸管水平涂開,使染液均勻覆蓋涂抹面,染色時間為5-10分鐘.
6.自來水細水沖洗染液,然后用吸水紙輕輕吸干玻片上的液體.
7.顯微鏡觀察結果,計數淋巴轉化細胞,計算轉化率.
[實驗結果]
轉化過程中,常見的細胞類型有：淋巴母細胞、過度型淋巴母細胞、核分裂相細胞和成熟淋巴細胞等.計數時,過度型淋巴母細胞和核分裂相細胞亦作為轉化細胞.
轉化率=轉化的淋巴細胞數/（轉化的淋巴細胞數+未轉化的淋巴細胞數）×100%

二 淋轉試驗3H-TdR摻入法
[實驗原理]
T淋巴細胞受 ConA或PHA激活后,進入細胞周期有絲分裂.當進入細胞周期S期時,細胞合成DNA量明顯增加,在培養基中加入氚（3H）標記的DNA前身物質胸腺嘧啶核苷（TdR）,則3H-TdR 被作為合成DNA的原料被攝入細胞,摻入到新合成的DNA中.根據同位素摻入細胞的量可推測淋巴細胞對刺激物的應答水平.摻入的同位素3H,經液體閃爍測量法測出,將3H每分脈沖數（cpm）加以計算,用不同公式表示結果.
同位素摻入法淋轉試驗,較之形態學方法更為客觀、準確,重復性也好,但需一定設備條件.
[實驗材料]
1.1640 培養液
2.ConA ：根據ConA 的純度配制成最適濃度,一般為5-10μg/ml .
3.脂溶形閃爍液：
POPOP（1,4 雙（5-苯基惡唑基-2）苯0.4g
PPO[2, 5二苯基惡唑]4g
無水乙醇 200ml
二甲苯 800ml
POPOP 先用少量二甲苯置 37 ℃ 水浴溶解后,再補足其他成分即可.
4.3H-TdR（市售商品）：臨用前用培養液稀釋成10μCi/ml .
5.多頭細胞收集儀、玻璃纖維濾紙、樣品杯,液體親爍計數器等.
[實驗方法]
1.無菌分離淋巴細胞（同E花環）,用1640培養液調制成1X106/毫升,加入96孔培養板,每孔100μl.
2.每孔加 ConA 100μl,每個樣品加3孔,另3孔不加ConA作對照.37℃培養約56小時.
3．結束培養前加入3H-TdR0.5-1.0μCi/孔.
4.繼續培養6-12小時后,用多頭細胞收集儀將細胞收集于玻璃纖維濾紙上.
5.烤干后,將濾紙放入閃爍杯中,每杯加閃爍液5毫升,液閃儀測定各管cpm .
[實驗結果]
將ConA刺激組和對照組各自的平均cpm值,代入下列公式計算ConA刺激指數（index of stimulation, SI）
SI=ConA 刺激管的cpm均值/對照管的cpm均值
三 淋轉試驗 MTT 法
[實驗原理]
MTT法（四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法）是Mosmann1983年報告的.原理是活細胞內線粒體脫氫酶能將四氮唑化物（MTT）由黃色還原為蘭色的甲肷,后者溶于有機溶劑（如二甲基亞楓、酸化異丙醇等）,甲肷產量與細胞活性成正比.可在560nm處用酶標儀測定其OD值.
[實驗材料]
1.MTT:PBS配制成5毫克/毫升的儲存液,過濾除菌后凍存.
2.溶劑:DMSO、10%SDS、0.04的鹽酸-異丙醇.
3.酶標儀
[實驗方法]
1.無菌分離淋巴細胞（同E花環）,用1640培養液調制成1X106/毫升,加入96孔培養板,每孔100μl.
2.每孔加ConA100μl,每個樣品加3孔,另3孔不加ConA作對照. 37℃培養約56小時.
3.結束培養前加入20μl/孔.繼續培養6小時左右.
4.2000轉/分鐘離心10分鐘,棄上清.
5.每孔加 100μl溶劑,輕微震蕩使甲肷產物溶解.
6.在酶標儀上波長560nm測定OD值.
[實驗結果]
SI=ConA刺激管OD均值/對照管OD均值.
[注意事項]
1.淋巴細胞要新鮮制備,否則會影響實驗結果.
2.ConA 刺激時間要根據淋巴細胞轉化情況決定,一般為55-66小時.