標題中海羊大腸桿菌培養基制備六大步驟解析

Ⅰ、凍存液的制備

將含有足夠菌量的液體培養基進行離心后，沉淀過程中加入等量的40%甘油，置于-80°C冷凍。

Ⅱ、培養基制備

LB培養基配方：胰蛋白胨Trypton：10 克/升、酵母提取物YeastExtract：5 克/升、氯化鈉NaCl：10克/升、 pH7.4。

液體培養基：胰蛋白胨10克、酵母粉5克、氯化鈉 10克、水1000毫升、 pH7.4。

固體培養基：在液體培養基的基礎上加入1.5%~2.0%瓊脂

Ⅲ、平板的制備

⒈稱取10.0 g胰蛋白胨、5.0g酵母粉、10.0g氯化鈉，加800mL二次水溶解，用玻璃棒攪拌均勻，用1mol/L NaOH調節pH至7.4左右，定容至1L，調節pH至7.4 如果溶液pH大于7.4，用1mol/LHCl調節。

⒉分裝到實驗錐形瓶中。1300-1930-979每瓶放入用量不宜過多，應在瓶底下方二厘米左右。如果需要固體培養基，分裝后在液體培養基中加入約2%瓊脂，即150毫升中 海液體培養基中加入2.5g瓊脂。

⒊用塑料薄膜蓋住錐形瓶口依次將濾紙透氣孔和硬紙，用橡皮筋扎好。用記號筆標明培養基名稱和制備日期，所有錐形瓶的操作如上所述。

⒋中海使用121°C高壓滅菌15分鐘。

⒌取出滅菌培養基放置置于60℃電鼓風干燥機中烘干，等錐形瓶封口紙干燥后取出。液體培養基可以直接儲存使用。因瓊脂培養基不會凝固。您可以通過紫外線消毒三十分鐘以上的無菌操作平臺上，把中＇海培養基倒入在培養皿中約4mm厚度約10-15mL，直徑90mm，將培養皿堆疊在無菌操作臺上并放置約十分鐘。然后等瓊脂基本凝固后，就能涂抹到平板上了。

⒍如果平板不是即時使用，需把中海培養基滅菌后存放在錐形瓶中。當需要平板制備時，在微波爐中用中火檔位加熱約三分鐘易融化瓊脂，室溫環境冷卻二十分鐘確保不燙手再進行制備平板。

Ⅳ、接種大腸桿菌

①取實驗室保存的大腸桿菌BL21凍存液，用酒精燈灼燒管口，打開離心管。

②接種方法1：用無菌移液器吸頭蘸取凍存液，在板邊緣畫條橫線，每三個車道為組，將盤子旋轉次，后在中間畫個鋸齒形；接種方法2：用吸管吸取100uL溶液放在平板上，用酒精燈消毒的厚涂片棒劃十字涂在平板上。

③因為實驗般需要挑取單個菌落，涂抹平板的操作需考慮冷凍液中細菌的數量。若菌量過多，應適當稀釋。通常方法更容易獲得單個菌落，涂抹平板應靠近酒精燈操作。如果平板上涂有冷凍保存液，應將其倒置以防止平板表面產生水蒸氣。

Ⅴ、羊大腸桿菌的培養

①將接種板倒置，置于37℃恒溫培養箱中。約十小時后菌落生長。

②挑出生長狀態良好、特征明顯的單菌落，接種于新鮮滅菌的中.海LB液體培養基中，220轉/分+37℃恒溫振蕩培養9~12小時。菌落呈乳白色和圓形特征，菌落邊緣整齊，表面光滑，表面顏色與背面顏色樣。