標題DEAE—離子交換劑純化血清IgG使用步驟及注意事項

DEAE-纖維素（Diethylaminoethyl-cellulose，DEAE）是在纖維素上引入二乙基氨基乙基，屬于弱堿型陰離子交換劑。吸附蛋白質的最適pH范圍為7～9，pH超過9.5，DEAE基團則不解離帶電荷。每克DEAE含0.96～1.24mmol/L可解離基團，與蛋白質的交換量可75-122mg/100mgDEAE。

    應用離子交換劑來純化物質，可以是把要純化的物質成分交換吸附于離子交換劑上，然后再分別洗脫下來獲得純品，或者把不需要的成分吸附于離子交換劑上，需要的成分直接流出，得到純品。本實驗采用DEAE-纖維素層析柱純化血清IgG，利用pH6.7的緩沖液溶解樣品IgG，此時IgG粗物中除IgG外，其他雜蛋白均帶上不同數量的負電荷，可以和DEAE上的陰離子發生交換吸附于柱上。IgG因不解離帶電，而不發生交換吸附，利用此特點，讓溶解后的樣品流過DEAE纖維素柱，即可直接收集到較純的IgG。

    （一）試劑及器材

    1.   0.0175mol/L， pH6.7，磷酸鹽緩沖溶液

    2.   奈氏試劑。

    3.   20%（W/V）磺基水楊酸溶液。

    4.   1cm×50cm

    5.   黑、白比色磁盤。

    （二）操作步驟

    1．活化

    根據所需層析柱的柱床體積計算所需DEAE的用量，稱取所需DEAE用蒸餾水浸泡過夜，其間換幾次水，每次除去細小顆粒。抽干，改用0.5ml/L NaOH溶液浸泡1h以上，抽干（可用布氏漏斗），用無離子水漂洗，使pH至8左右（用pH試紙檢查）。再改用0.5ml/L HCl溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用無離子水洗至pH6左右。然后用0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，浸泡平衡后使用。

    2．裝柱

    用0.0175mol/L，pH6.7，磷酸鹽緩沖溶液浸泡已處理好的DEAE-纖維素，并更換1～2次。然后攪拌均勻，灌入層析柱中，直至纖維素柱床高約17cm左右為止。柱床形成后，在洗脫瓶裝入0.0175mol/L pH6.7磷酸鹽緩沖溶液，接在層析柱上口，打開柱下端出口，使磷酸鹽緩沖溶液流過纖維素，直至流出液的pH值與磷酸鹽緩沖溶液的pH值完全相同（用pH試紙不斷檢查）為止。

    3．上樣 

    上述平衡過程完畢后，關閉柱下口。用滴管吸去纖維素柱面上的深液（但不能低于柱下口），控制流速使樣品慢慢進入纖維素內。待全部樣品進入柱后，在柱床面上加一層0.0175mol/L  pH6.7 磷酸鹽緩沖溶液。

    4．洗脫

    連接洗脫瓶，打開柱下口開始洗脫�？刂屏魉贋�0.5ml/min， 用試管收集洗脫液，每管10滴。從每滴中取1滴收集液放入在黑色比色盤孔中，加入1滴20%磺基水楊酸檢查是否產生白色沉淀。在此條件下在收集液中首先出現的蛋白質即為純化的IgG。因此，從洗脫開始就應收集洗脫液，直至收集液中無蛋白質出現為止（加磺酰水楊酸不呈白色沉淀），合并含有蛋白質的各管收集液中無蛋白質即為純化的IgG溶液。

    5．再生 

    用過的離子交換劑可以反復使用，使其恢復原狀的方法俗稱“再生”。 由于DEAE-纖維素使用后因帶有大量雜蛋白，所以再生時，先用0.5ml/L NaOH浸洗，用無離子洗至pH8左右，然后用0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖溶液浸泡即可轉型再使用。

    6．鑒定 

    純化后獲得的蛋白質樣品均應進行鑒定后方能證明產品的合格性。