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              標題關于PCR,你知道多少?----幾種特殊的PCR

                 

              提供者:上海遠慕生物科技有限公司    發布時間:2019/9/5   閱讀次數:270次 >>進入該公司展臺

              1、錨定PCR(anchored PCR)

              通常采用的PCR反應必須知道欲擴增的DNA或RNA片段兩側的序列,而在大多數情況下對某些序列本身或其旁側序列并不清楚,“錨定PCR”可以幫助克服序列未知或序列完全未知帶來的障礙。

              基本做法是:分離細胞總RNA或者mRNA,在反轉錄酶的作用下合成cDNA,通過DNA末端轉移酶在cDNA 3’末端加上poly(dG)尾巴。與此poly(dG)相對應的錨定引物poly(dC)為保證擴增特異性,建議此段旁聚(dC)在十二聚以上,5’端可帶上某些限制酶序列或其他序列信息。在與基因特異配對的引物參與下,可以擴增出此帶同源多聚物尾巴的cDNA序列。

              2、不對稱PCR(asymmetric PCR)

              典型的PCR反應產生一種特定的雙鏈DNA拷貝,不對稱PCR可以利用引物濃度的差別,形成單鏈DNA,便于測序。一般采用50~100:1比例的引物濃度,在最初的10~15個循環中主要產物還是雙鏈DNA,但當低濃度引物被消耗盡時,高濃度引物介導的PCR反應就會產生大量的單鏈DNA,分離此擴增產物中的ssDNA可用原引物或第三條內部引物直接測序。

              3、反向PCR(inverse PCR)

              PCR反應允許擴的DNA片段位于已知序列的兩個引物之間。反向PCR的應用則可以對一個已知的DNA片段的兩側未知序列進行擴增和研究。選擇已知序列內部沒有的限制性內切酶對此段DNA進行酶切,連接成環狀DNA分子,選擇合適方向和已知序列兩末端互補的引物,經PCR后,可以得到未知序列的DNA片段,用此方法可建立基因組步移文庫。

              4、多重PCR(multiplex PCR)

              PCR技術的一個重要應用領域是檢測特定序列的存在或缺失。如果待檢測的基因片段存在,經PCR可以產生擴增區帶,如果缺失則沒有擴增帶出現。在許多情況下需要檢測的基因十分龐大,有的可達數百上千kb。對此有人提出了多重PCR,即在同一個試管中加入多對引物,擴增同一模板的幾個區段。如果某一區段缺失則在相應的電泳圖譜上這一區帶就會消失。多重PCR和southern blotting 一樣可靠,但要簡便的多。

              5、著色互補PCR(color complementation assay)

              著色互補PCR又稱熒光PCR,可用于區分長短相近的多種基因成分。其原理是用不同的熒光染料,如紅色的羅丹明(POX)和綠色的熒光素(FAM)等分別標記于不同的寡核苷酸引物上,同時擴增多個DNA區段,反應完畢后,利用分子篩除去延伸的引物。用紫外線照射擴增產物,就能顯示某一種或幾種熒光染料顏色的組合,如果某一DNA區帶缺失,則會缺乏相應的顏色,據此可以很快診斷出是否某種基因缺失,或者發現某些感染的病毒。

              關鍵詞:PCR    

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