無縫克隆又叫同源重組，它可以將單個至多個片段同時插入到一個載體中，而不需要進行多次的酶切和純化。通常情況下，無縫克隆可以在 5-15 min內完成多個片段的連接，其克隆陽性率高達 98% 以上。但需要注意的是，我們在無縫克隆前進行 PCR 擴增的時候，載體與片段之間、片段與片段之間需有 15-20 堿基的一段同源序列，這是為什么呢？因為我們無縫克隆的試劑盒里面存在三種酶，分別是 T5 核酸外切酶、DNA 聚合酶、DNA 連接酶。其中 T5 核酸外切酶具有 5’-3’核酸外切酶的活性，能夠將序列從 5’-3’開始降解，此時暴露出載體以及片段的3’同源序列，經過堿基互補配對，DNA 聚合酶添加缺失堿基后由 DNA 連接酶將片段與載體進行連接，從而達到載體重組的功能。因此，如果不添加同源序列，載體與片段、片段與片段之間將無法進行連接。
無縫克隆引物設計大家現在對無縫克隆已經有一個深入的了解了，那么我們來看看，在做無縫克隆之前，跑 PCR 的時候引物設計有哪些要求呢？
引物添加的順序 5’-3’：
同源序列+特異性引物（克隆后無需進行酶切，適用于表達載體）
同源序列+保護堿基+酶切位點+特異性引物（克隆后還需要進行酶切或者亞克�。�這里需要提醒大家注意一下，由于無縫克隆的引物在普通 PCR 的引物基礎上添加了額外的附加堿基（同源序列、保護堿基、酶切位點），Tm 值可能會較常規引物的高。但我們在做 PCR 的時候，第一、二次循環，幾乎只有特異性引物的序列與模板結合，此時應該只計算特異性引物的 Tm 值，否則會出現退火溫度過高，PCR 擴增不出條帶。但后面的循環，特異性引物和附加堿基均能夠和第一、二次擴增產物為模板進行結合擴增，并占據絕對優勢。此時引物 Tm 值應該按照整條引物的 Tm 值計算。因此，在做無縫克隆前的 PCR 擴增時，建議大家在第二個循環后提高退火溫度進行 PCR 擴增，更有利于產物的形成。
無縫克隆的連接時間的選擇雖然說，無縫克隆帶給我們很多的便利，但小編需要告訴大家需要注意一點兒的是，無縫克隆連接的片段數量有限，一次連接超過 6 個或者載體+片段超過 13 Kb 后，其連接時間會增加且陽性率會降低，甚至出現實驗失敗的情況。因此，在做無縫克隆實驗的時候需要多多計算一下。
