10x Genomics 單細胞項目一直是如火如荼，而單細胞懸液制備順勢成為該項目的關鍵，小編整理了遠慕生物 2 年多 10x 項目經驗及 10x Genomics 官方網站相關資料，為你帶來神秘「單細胞懸液制備」秘籍。
為保證細胞活力，新鮮的樣本不能凍存且長距離運輸，小編建議提前預約，公司會安排上門建庫服務。上機前樣本要求如下：
- 細胞濃度：5x105~1.2x106/ml
- 細胞數量：1x105 cells/sample
樣本制備的具體方案因樣本類型而異，但無論采用哪種方案，都必須確保上樣的細胞有活性。對于懸浮細胞系、磁珠富集細胞和流式分選細胞已呈懸浮狀態，只需要洗滌和計數即可。固體組織和其他大細胞聚合體必須使用機械或酶解離，細胞分選或其他細胞分離技術解離成單細胞懸液狀態。
樣本制備一般有什么策略？
- 組織樣品須通過酶促解離制成單細胞懸液
- 細胞數量較少（小于 100 000）的樣品可適當減少洗滌次數
- 細胞直徑過大的樣品，可以分離細胞核，制備細胞核懸液
- 植物細胞須去除細胞壁得到原生質體懸液
樣本制備應遵循什么原則？
- 建議使大口徑槍頭重懸，以減少對細胞的損傷
- 每次移液前先混勻細胞懸液，然后從管中部吸取
- 棄上清時注意不要破壞細胞沉淀
- 取樣時最好設置兩個重復，對每個樣品計數 2 次
- 一般選用含 0.04 % BSA（400 μg/ mL）的 1× PBS 溶液重懸和洗滌細胞
- 重懸細胞濃度洗滌和重懸細胞時，總體積濃度不低于 5 000 個細胞/μl；最理想的范圍保持在 700～1200 cells/ μL，此濃度下計數較為準確
- 有些細胞如 PBMC 在 PBS 中易成團狀，從而降低細胞的有效濃度，因此制備細胞懸液要迅速，最好在 30 分鐘內完成
- 最佳上樣體積為 2.5 μL～15 μL
樣品質量有什么要求？
- 懸液干凈、無過多雜質及細胞團
- 細胞存活率>90%（比較難處理的樣本可以放寬至>80%）
- 細胞直徑<40 um
若單細胞懸液中存在死亡或垂死細胞，細胞團，細胞碎片，游離 mRNA 會導致：
- 細胞捕獲率低
- 低文庫復雜性（UMI 檢出率下降/gene 表達量低）
- 有效細胞 reads 數低
- cDNA 得率偏低
如何獲取高質量樣品？
1. 細胞清洗：
推薦的洗滌懸浮液為含 0.04％ BSA 的 PBS，至少洗滌一次，減少細胞損失或聚。
原代細胞，干細胞和其他敏感細胞類型需最大細胞活力，必要時可用常見細胞緩沖液替換 PBS。
2. 細胞過濾：
細胞團或細胞碎片會增加微流體芯片的堵塞風險。為避免這種狀況，建議在上樣前使用細胞濾網（cell strainer），孔徑大約為 30～40 μm，進行過濾。
低細胞懸浮液體積建議使用 Flowmi™Tip 過濾 , 樣品體積損失小，細胞濃度降低 30% 左右。
常規體積建議使用 MACS SmartFilter 過濾，樣品體積損失 100 ul 左右，細胞濃度影響不大。
3. 準確測定細胞活力
4. 組織優化分離方案
適宜制備時間
適宜分離條件（時間/溫度/酶類型和濃度/離心轉速、溫度、時間）
5. 大口徑移液管對細胞進行吹打，避免造成細胞損傷。
細胞計數有什么策略？
計數結果干擾會過低或過高估計細胞存活率，細胞上樣濃度一般：700～1200 個細胞/µl 的范圍。在第一次表征樣品類型時，建議進行兩種不同的方法計數和活力測定。
- 臺盼藍染色法，操作簡單，但小細胞難以準確計數及活力測定
- 熒光染料染色法，結果相對直觀，計數和活力準確
如果，細胞數<100 000，樣本制備應該注意什么？
- 樣品分選至合適培養基
- 清洗前進行一次計數
- 水平離心機離心，PBS 至少清洗一次
溫馨小提示：此「單細胞懸液制備」秘籍僅供參考，各位老師還需根據實際樣本選擇適合的單細胞懸液制備方案。
