標題組織樣本的western blot，這十點需要注意

利用組織樣本來進行Western blot，這是許多實驗室常常開展的工作。不過，若是想獲得重復可靠的印跡結果，也絕非易事。在此，Bio-Rad的專家貢獻了一些經驗，可以幫助您獲得清晰的圖像和可靠的數據。

1. 快速處理組織

使用干凈的工具來收集和處理組織樣本。為了去除可能影響蛋白穩定性的污染物，用預冷的中性緩沖液簡單洗滌。洗滌后，在液氮中快速冷凍組織，以便保留蛋白的結構和特征，比如翻譯后修飾（PTM）。組織樣本可保存在冰上，立即勻漿處理。若保存在 –20°C，蛋白仍然有可能降解，因此組織樣本要放在–80°C長期保存。

2. 精心挑選裂解液

在選擇最佳的裂解緩沖液時，應考慮pH值、離子強度、去污劑和變性劑類型等因素。放射免疫沉淀分析緩沖液（RIPA）是最廣泛使用的裂解液。同時，在選擇過程中也要考慮目標蛋白的定位，例如，細胞質蛋白建議選用Tris-HCl裂解液，而核蛋白則首選RIPA。在富集各個組分的低豐度蛋白時，可能需要對組織組分進行預先分離。裂解液的用量取決于組織的大小/重量；緩沖液與組織的比例對確保有效裂解很關鍵。

3. 選擇破碎方法

與細胞相比，組織需要更劇烈的破碎方法，如勻漿技術。為了進一步解離組織并剪切細胞DNA，可能需要對樣本進行超聲處理。這一步要避免起泡，因為它會降低回收率。同時，脂質會影響western blot的質量，要盡量去除。從植物組織中提取蛋白也頗具挑戰性，因為它們富含蛋白酶，還含有大量可能干擾蛋白提取的代謝物。您必須針對特定的植物組織來優化提取過程。

4. 抑制蛋白降解

細胞膜的破壞會釋放出可降解蛋白質的酶。為了限制蛋白酶的活性，可以向緩沖液中加入尿素等強變性劑，不過這些條件可能會影響某些蛋白質的完整性，因此，裂解液中通常含有蛋白酶抑制劑混合物。常用的蛋白酶抑制劑包括PMSF、抑肽酶、亮抑酶肽和胃蛋白酶抑制劑。

SUMO化蛋白的鑒定可能特別有難度，因為去除SUMO的異肽酶存在，并且通常只有一小部分蛋白被SUMO化。為了保留SUMO化，建議在裂解液中加入異肽酶抑制劑。去泛素化酶（DUB）的存在也會去除泛素結合物。因此，必須向細胞裂解液中加入EDTA或EGTA，以及碘乙酰胺（IAA）或N-乙基馬來酰亞胺（NEM）。IAA和NEM的使用濃度通常為5-10 mM。不過，某些蛋白可能需要更高的濃度，比如IRAK1。

5. 定量您的樣本

測定樣本濃度，可確保每塊凝膠的上樣量相同，并方便比較各個樣本之間的蛋白水平差異，比如處理和未處理樣本，或實驗各個階段的樣本。您可以采用Bradford分析來進行總蛋白的標準化。不過，如果樣本中包含不可溶和可溶蛋白，則Bradford方法不可靠，再次強調了均質化的重要性。

6. 選擇最好的凝膠

最好是根據目標蛋白的分子量來選擇聚丙烯酰胺的百分比。例如，高分子量蛋白選擇低的百分比，而低分子量蛋白選擇高的百分比。如果您希望檢測單個蛋白質，選擇非梯度膠。如果是檢測一系列不同大小的蛋白，則建議選擇梯度膠。電壓太高，可能會引起“微笑”條帶。為了避免這種情況，建議在冷庫中跑膠，并使用預冷的緩沖液。

7. 驗證蛋白上樣

根據您的蛋白在細胞中處于哪個位置，可選擇最佳的上樣對照。對于細胞質中的蛋白，常用的對照是看家蛋白β-肌動蛋白或β-微管蛋白；對于核蛋白，通常使用組蛋白H1或組蛋白H3。不過，近年來許多研究表明最常用的看家蛋白不適合蛋白的歸一化，強調生理和病理因素可能影響它們的表達水平。另一個問題是看家蛋白往往超出了檢測的動態范圍。

Bio-Rad的免染（stain-free）成像技術則是一種很好的替代。這種技術利用總蛋白來進行歸一化，有助于消除實驗誤差，得到更可靠的結果。它無需染色，利用摻入凝膠的三鹵化合物，讓蛋白質在光活化時發出熒光。與麗春紅染色相比，免染技術擴大了線性檢測的范圍，并降低了實驗的可變性。此外，轉印后也無需染色，非常方便。

8. 選擇合適的膜

蛋白質可轉印到硝酸纖維素（NC）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。PVDF膜的機械強度更高，特別適合膜的剝離和再次結合。PVDF膜是疏水性的，需要在甲醇中預浸泡。NC膜的信噪比高，不需要甲醇預處理。需要注意的是，NC膜不能與含有SDS的轉移緩沖液一起使用。在選擇轉印膜時，您可能還需要考慮其他參數，比如孔徑。

9. 降低內源背景

在對組織裂解物進行western blot檢測時，內源IgG的信號和非特異性二抗結合可能會掩蓋低豐度的蛋白或某種分子量的蛋白。~50 kD和~25 kD的蛋白尤其需要注意，它們可能被變性IgG的重鏈和輕鏈所掩蓋。對于胸腺或甲狀腺等組織，這個問題尤為明顯，因為它們含有大量的內源IgG。

TidyBlot Western Blot檢測試劑僅僅結合完整結構的非變性IgG，不會受樣本中存在的IgG干擾。它可以直接代替傳統二抗使用，為組織樣本的檢測帶來清晰的背景。

10. 采用適當的對照

為了確保一抗的特異性，必須使用陽性和陰性的組織對照。對于陽性對照，使用已知表達高水平目標蛋白的組織。推薦的陰性對照包括僅使用二抗（省略一抗孵育步驟）以及已知不表達目標蛋白的組織樣本。此外，疾病狀態下特定蛋白質的表達也會出現差異。為了解釋這些差異，最好使用健康組織和疾病組織的樣本。