標題細胞凋亡檢測方法---DNA片斷化檢測

       細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質發生濃縮, 染色質DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50~300kbp長的DNA大片段, 或180~200bp整數倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜(DNA ladder).細胞經處理后,采用常規方法分離提純DNA,進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色,在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNA ladder.如果細胞量很少,還可在分離提純DNA后,用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)使DNA標記,然后進行電泳和放射自顯影,觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成.

1. 大分子染色體DNA片段的測定

       細胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50~300kbp長的DNA大片段.所有超過一定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同.線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時,即達到分辨力的極限.此時凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA,DNA像通過彎管一樣,以其一端指向電場一極而通過凝膠,這種遷移模式稱之為"爬行".因此,細胞凋亡早期產生的50~300kbp長的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離.通常采用脈沖電泳技術可圓滿地解決這一問題.這個方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場.每當電場方向改變后,大的DNA分子便滯流在爬行管中,直至新的電場軸向重新定向后,才能繼續向前移動.DNA分子量越大,這種重排所需要的時間就越長.當DNA分子變換方向的時間小于電脈沖周期時,DNA就可以按其分子量大小分開.

參考文獻
Brown,D.G., Sun, X.M., ａnd Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039

2. DNA Ladder 測定

方法:收獲細胞(1′107)沉淀?細胞裂解液?13000rpm′5min, 收集上清?1%SDS和RnaseA(5mg/ml)56°C,2h?蛋白酶K(2.5mg/ml)37°C,2h?1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無水乙醇沉淀DNA,4°C過夜?14000rpm′15min?最后將沉淀溶解在TE buffer中,加DNA Loading Buffer?1.2%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色并照相.

結果圖

參考文獻 Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid ａnd simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507

3. 凋亡細胞DNA含量的流式細胞計分析

方法:收集細胞?70%冷乙醇(in PBS)4°C固定過夜?PBS洗滌,1000rpm′10min?RNase A(0.5mg/ml)37°C消化30min?PI(50mg/ml)染色,室溫避光15min?FACScan分析DNA亞二倍體的形成及細胞周期的變化.

結果圖

4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)

優點：敏感度高，適合于檢測少量樣本，小部分凋亡細胞。如臨床活組織檢測。