標題RT- PCR反應原理

RT- PCR反應原理

1. 從細胞或特定組織中提取總RNA。
2. 逆轉錄實驗。
3. 擴增內參和目的基因并比較基因表達差異。

RT-PCR反應受多個因素影響，
如硫酸鎂的濃度, 引物退火的溫度，擴增的循環數等。

 

　　◇建議選擇0.5-3.0 mM （相差0.5 mM）的硫酸鎂作初步實驗。

 

　　◇對于具有較高Tm的引物，增加退火和延伸時的溫度對反應有利。較高的溫度有利于減少非特異的引物結合，因而提高特異產物的得率。

 

　　◇大多數目標RNA經40輪PCR反應就能觀察到。但如果目標RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加擴增的次數到45-50次。

隨機引物	適用于長的或具有發卡結構的RNA。適用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反轉錄反應。主要用于單一模板的RT-PCR反應。
Oligo dT	適用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要結合到PolyA 尾巴上，所以對RNA樣品的質量要求較高，即使有少量降解也 會使全長cDNA合成量大大減少。
基因特異性引物	與模板序列互補的引物，適用于目的序列已知的情況。天為時 性引物 代公司的SuperScript One-Step System特別適合于與基因特異性 引物連用。