標題小鼠組織蛋白去乙�；�酶(HD)ELISA試劑盒說明書

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本試劑盒僅供研究使用

檢測范圍：2.4 pg/ml - 600 pg/ml

特異性：本試劑盒可檢測小鼠HD，且與其他相關蛋白無交叉反應。
有效期：6個月
預期應用：ELISA法定量測定小鼠血清或其它相關生物液體中HD含量。
說明
1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
3．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
4．剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正�，F象，不會對實驗結果造成任何影響。
實驗原理
用純化的羊抗小鼠包被微孔板，制成固相載體，然后向微孔中依次加入標本或標準品、HRP標記的HD以及抗HD抗體，經過徹底洗滌后用底物溶液顯色。底物在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的HD呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯板（Assay plate ）：一塊（96孔）。
2. 標準品（Standard）：5×0.5 ml/瓶。
標準品 S1 S2 S3 S4 S5
濃度
（pg/ml） 2.4 9.3 37.5 150 600

3. 酶結合物（HRP-Conjugate）：1×6 ml/瓶。
4. 抗體（Antibody）：1×6 ml/瓶
5. 底物溶液A（Substrate A）：1×7ml/瓶。
6. 底物溶液B（Substrate B）：1×7ml/瓶。
7. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×15ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋20倍。
8. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

需要而未提供的試劑和器材
1. 標準規格酶標儀
2. 高速離心機
3. 電熱恒溫培養箱
4. 干凈的試管和Eppendof管
5. 系列可調節移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，最好用多通道移液器
6. 蒸餾水，容量瓶等
標本的采集及保存
血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
標本的稀釋原則：
首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當的稀釋倍數。只有稀釋至標準曲線的范圍內，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中，應做好詳細的記錄。最后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。
操作步驟
實驗開始前，請提前配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用先進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1. 加樣：設一個空白對照孔，不加任何溶液。余孔分別加標準品或待測樣品50μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁。
2. 每孔加酶結合物 50μl和抗體50μl，空白孔不加。充分混勻，37℃溫育1小時。
3. 溫育后，棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。
4. 依序每孔加底物溶液A和B各50μl，37℃避光顯色15分鐘內。
5. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。
6. 用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內進行檢測。
注：
1. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到管底。
2. 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。
3. 為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜。
4. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據需要，重復此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
計算
以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。
注意事項
1. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。
2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
3. 一次加樣時間最好控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。
5. 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請最后乘以稀釋倍數。
6. 底物請避光保存。
7. 不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。