標題酶的生產與分離純化

酶的生產與分離純化

 主要內容：

            2.1 國內外酶制劑工業生產及應用現狀

            2.2 酶的發酵技術

            2.3 酶的分離純化

            2.4 酶分離、純化的評價

            2.5 酶的劑型與保存

2.1國內外酶制劑工業生產及應用現狀

2.1.1 ．新技術在生產中的應用：

w  三種方法：

n  組織提�。耗竟系鞍酌�、凝乳蛋白酶

n  微生物發酵：最大量的來源

n  化學及生物合成：生物重組

w  高新技術的應用：酶的修飾、固定化、基因重組、膜分離技術、冷凍干燥、微膠囊

2.1.3.  品種、規模不斷擴大

w 目前30多家600多個品種，應用于18個工業領域。

w 我國2000年酶制劑產量為30萬噸，100家，市場份額僅占5%，以未經除菌去渣的粗制品粉狀酶為主。

w 國際以液體、顆粒為主。

w 國內糖化酶、ａ-淀粉酶、蛋白酶三大類占了97%，顯然不合理。

w 重要產品普魯蘭酶、真菌淀粉酶、系列果膠酶、低溫堿性蛋白酶，國內尚未投入生產;

w 我國有7家上市公司介入酶制劑開發生產。

2.1.4.  應用領域不斷擴大：

w 美國酶制劑年產值6.25億美元，食品工業占62%，拓展飼料工業、洗滌劑工業、化學工業。

2.2  酶的發酵技術

w 利用微生物產酶的優點是：

n （1） 微生物種類多、酶種豐富，且菌株易誘變，菌種多樣。

n （2） 微生物生長繁殖快，易提取酶，特別是胞外酶。

n （3） 微生物培養基來源廣泛、價格便宜。

n （4） 可以采用微電腦等新技術，控制酶發酵生產過程，生產可連續化、自動化，經濟效益高。

n （5） 可以利用以基因工程為主的現代分子生物學技術，選育菌種、增加酶產率和開發新酶種。因此，下面將主要介紹微生物發酵法產酶的一般原理和工藝。

2.2.1  產酶微生物

w 菌種是發酵生產酶的重要條件。菌種不僅與產酶種類、產量密切相關，而且與發酵條件、工藝等關系密切。已經在自然界中發現的酶有數千種，目前投入工業發酵生產的酶約有50～60種。它們的生產菌種十分廣泛，包括細菌、放線菌、酵母菌、霉菌。

2.2.2  酶的發酵技術

w 2.2.2.1 培養基

n  培養基的營養成分是微生物發酵產酶的原料，主要是碳源、氮源，其次是無機鹽、生長因子和產酶促進劑等。

（1）碳源

w  碳素是構成菌體成分的主要元素，也是細胞貯藏物質和生產各種代謝產物的骨架，還是菌體生命活動的能量的主要來源。當前酶制劑生產上使用的菌種大都是只能利用有機碳 的異養型微生物。有機碳的主要來源有：一是農副產品中如甘薯、麩皮、玉米、米糠等淀粉質原料；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉質原料。此外，以石油產品中12 ～16 碳的成分來作碳源，如以某些嗜石油微生物生產蛋白酶、脂酶，均已獲得成功。

n  不同的細胞對各種碳源的利用差異很大，所以在配制培養基時應根據不同細胞的不同要求而選擇合適的碳源。另外，選擇碳源除考慮營養要求外，還要考慮酶生物合成的誘導作用和是否存在分解代謝物阻遏作用。盡量選用具有誘導作用的碳源，盡量不用或少用有分解代謝物阻遏作用的碳源。

n 例如，α－淀粉酶的發酵生產中，應該選用有誘導作用的淀粉作為碳源，而不用對該酶有分解代謝物阻遏作用的果糖作為碳源。

w （2）氮源

n  氮是生物體內各種含氮物質，如氨基酸、蛋白質、核苷酸、核酸等的組成成分。酶制劑生產中的氮源主要有有機氮源和無機氮 源兩種，常用的有機氮源有：豆餅、花生餅、菜籽餅、魚粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；無機氮源有：（NH4）2SO4 、NH4Cl 、NH4NO3 、（NH4）3P04 、尿素等。

n  不同的細胞對各種氮源的要求各不相同，應根據要求進行選擇和配制。一般來說，動物細胞要求有機氮，植物細胞主要要求無機氮。多數情況下將有機氮源和無機氮源配合使用才能取得較好的效果。例如黑曲霉酸性蛋白酶生產，只用銨鹽或硝酸鹽為氮源時，酶產量僅為有胨時的30% 。只用有機氮源而不用無機氮源時產量也低，故一般除使用高濃度有機氮源外尚需添加1%~3% 的無機氮源。

w （3） 碳氮比

n  在微生物酶生產培養基中碳源與氮源的比例是隨生產的酶類、生產菌株的性質和培養階段的不同而改變的。

n  一般蛋白酶 （ 包括酸性、中性和堿性蛋白酶）  生產采用碳氮比低的培養基比較有利，例如黑曲霉3.350 酸性蛋白酶生產采用由豆餅粉3.75 % 、玉米粉0.625% 、魚粉0.625% 。NH4Cl 1% 、CaCl2 0.5% 、Na2HP04 0.2% 、豆餅石灰水解液10% 組成的培養基；  

n  淀粉酶（ 包括α －淀粉酶、糖化酶、β －淀粉酶等） 生產的碳氮比一般比蛋白酶生產略高，例如枯草桿菌TUD127α －淀粉酶生產采用由豆餅粉4 % 、玉米粉8 % 、Na2HP04 0.8% 、 （NH4）2SO4 0.4% 、CaCl2 0.2% 組成的培養基。而在淀粉酶生產中糖化酶生產培養基的碳氮比是最高的。以上是蛋白酶和淀粉酶生產培養基碳氮比的一般規律，但是由于菌種很多而其性質各異。很難說都是符合上述規律的。

n  在微生物酶生產過程中，培養基的碳氮比也因培養過程不同而異。例如種子培養時，為了適應菌體生長繁殖的需要，要求提供合成細胞蛋白質的氮多些，容易利用的氮源的比例大些，種子培養基的碳氮比一般要比發酵培養基低些。發酵時，不同發酵階段要求的碳氮比也是不同的。例如在枯草桿菌BF －7658 生產α －淀粉酶的發酵過程中，發酵前期要求培養基的碳氮比適當降低，以利菌體生長繁殖，發酵中后期要求培養基的碳氮比適當提高，以促進淀粉酶的生成。

w （4） 無機鹽

n 微生物酶生產和其他微生物產品生產一樣，培養基中需要有磷酸鹽及硫、鉀、鈉、鈣、鎂等元素存在。在酶生產中常以磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等磷酸鹽作為磷源，以硫酸鎂為硫源和鎂源。鈣離子對淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多種酶的活性有十分重要的穩定作用，例如在無Ca2+存在時灰色鏈霉菌中性蛋白酶只在pH7~7.5很小范圍內穩定，當有Ca2+存在時穩定pH范圍可以擴大到5～7。鈉離子有控制細胞滲透壓使酶產量增加的作用，酶生產的培養基中有時以磷酸氫二鈉及硝酸鈉等形式加入，例如米曲霉α－淀粉酶生產，添加適量的硝酸鈉以促進酶生產。

n 在天然培養基中，一般微量元素不必另外加入，但也有一些例外。如玉米粉、豆粉為碳源時，添加100 ppm Co2+和Zn2+，放線菌166蛋白酶活力可增加70%～80%。