GBT 18397-2001混合飼料中泛酸的測定高效液相色譜法
本標準規定了用高效液相色譜儀測定復合預混合飼料中泛酸含量的方法。
本標準適用于復合預混合飼料、維生素預混合飼料中泛酸的測定，也適用于濃縮飼料中泛酸的測定，測量范圍為每千克樣品中含泛酸在50 mg以上。
方法原理
試樣中的泛酸經水提取，用磷酸緩沖液（pH 5.5 ）通過高效液相色譜C18柱進行分離，用紫外檢測器在200nm處外標法進行定量測定。
試劑和材料
除特殊注明外，本標準所用試劑均為分析純，水為去離子水，應符合GB/T 6682三級用水的規定。
1.1 0.1%磷酸溶液。
1.2 %乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）溶液。
1. 3 磷酸緩沖液:稱取3.12 g二水磷酸二氫鈉（NaH2PO4-2H2O）溶于1L水中，用氫氧化鈉溶液c（NaOH）=0.1m ol/L調節至pH5.5，通過0.45um濾膜過濾脫氣備用。
1.4 泛酸（或泛酸鈣）標準溶液。
1.4.1 泛酸（或泛酸鈣）標準儲備液:準確稱取已知純度的D-泛酸（或D-泛酸鈣）標準純品0.02 g ,置于100ml棕色容量瓶中，用0.1%磷酸溶液（1.1）溶解、定容至刻度，搖勻。
1.4.2 泛酸（或泛酸鈣）標準工作液:精密吸取標準儲備液（1.4.1）用水按1:10比例稀釋，現用現配該溶液濃度為每毫升含D-泛酸（或D一泛酸鈣）20 ug,
1.5 氫氧化鈉溶液:c（NaOH）=1 mol/L.
1.6 鹽酸溶液:c（HaOH）二1 mol/L.
儀器設備
pH計。
超聲波水浴。
超純水裝置（Millipore或全磨口玻璃蒸餾器）。
離心機:3000 r/min,
GE-200液相色譜儀:帶8725i進樣器，UV紫外檢測器。
試樣制備
選取有代表性的樣品至少500g ，四分法縮減至100g ,磨碎，全部通過0.28mm孔篩，混勻，裝人密閉容器中，避光低溫保存備用。
分析步驟
2.1 試驗溶液的制備
2.1.1 復合預A合飼料:稱取試樣1-2g 或維生素預混合飼料0.25-0.5g ,精確至0.0001g ，置于100mL棕色容量瓶中。加60mL水浸濕，搖勻，加10mLl%二乙胺四乙酸二鈉溶液（1.2）混勻，置于超聲波水浴上振蕩提15min。用水定容至刻度混合均勻。過濾或離心。再經0.45 um過濾膜過濾，調整溶液的濃度大于1ug/mL，供高效液相色譜分析用。
2.1.2 濃縮飼料:稱取試樣2-5g ,精確至0.0001g,置于100m L棕色容量瓶中。加60m L水浸濕，搖勻，加10mLl%二乙胺四乙酸二鈉溶液棍勻，置于超聲波水浴上振裁提取15min。提取液若出現混濁，需用幾滴氫氧化鈉溶液（1.5）和鹽酸溶液（1.6）調節pH至4.5左右，至溶液澄清（用試紙顯示）沉淀蛋白質，用水定容至刻度，以下步驟同2.1.1。
注:當濃縮飼料每千克樣品中泛酸含量低于50mg時，可增加稱樣量.
2.2 測定
2.2.1 色譜條件
固定相 : ODS（C18）粒度5um。柱長150mm、內徑3.9mm不銹鋼柱。
移動相 : 磷酸緩沖液（1.3）,
流速: 1. 0 m L/min
溫度:室溫。
進樣量: 10-20ul
檢測器: 紫外檢測器（或二極管矩陣檢測器PDA）使用波長200nm
2.2.2 定量測定
按高效液相色譜儀說明書調整儀器操作參數和靈敏度（AUFS），色譜峰分離符合要求。用兩次以上相應標準工作液對系統進行校正，向色譜柱注入相應的泛酸或泛酸鈣的標準工作液〔1.4.2（Vst）」和試驗溶液「2.1（Vi）〕得到色譜峰面積響應值（Pst,Pi），用外標法定量測定。
結果的計抹與裹述
3.1 復合預混合飼料中泛酸的含量按式（1）計算:wi=Pi×V×pi×Vsi×f/Pm×m×Vi
wi一每千克試樣中泛酸的含量,mg;
m一試樣質量g;
V一提取液的總體積，ml;
pi一泛酸（或泛酸鈣）標準工作液濃度，ug/mL;
Vsi一泛酸（或泛酸鈣）標準工作液進樣體積，uL;
Vi一從試驗溶液中分取的進樣體積，uL;
Pm一與標準工作液進樣體積Vsi）相應的峰面積響應值;
Pi一與從試驗溶液中分取的進樣體積（Vi）相應的峰面積響應值;
f一轉換系數，用泛酸作標準物質時，系數為1;用泛酸鈣作為標準物質時轉換成泛酸，系數為0.920 （1 mg泛酸相當于1.087mg泛酸鈣）。
3.2 平行測定結果用算術平均值表示，保留小數點后一位。
允許差
同一分析者對同一試樣同時兩次平行測定所得結果相對偏差見表表1
每千克試樣中泛酸含量.mg 相對偏差%
50-2000 ≤士10
> 2000 ≤士5.0
復合預混合飼料中泛酸的測定，目前尚無國際標準可依，本標準是在查閱國內外文獻的基礎上，參考《美國全國飼料協會（NFIA）分析方法概要》報導的方法“高效液相色譜方法測定液體和固體多種維生素添加劑中抗壞血酸、煙酸、煙酞胺、泛酸鈣和泛醇的含量”而制定的。
本標準在技術內容上參考國外方法，其方法原理相同;對范圍、試樣提取條件、稱樣量、高效液相色譜測定條件進行了改進，并做了明確規定。該法簡便、快速、準確。
本標準由全國飼料工業標準化技術委員會提出并歸口。
本標準起草單位:國家飼料質量監督檢驗中心（北京）。
本標準主要起草人:陳必芳、李蘭、林東下。
