標題CPZ誘導精神分裂癥樣模型小鼠的行為學變化研究

 【摘 要】目的：研究雙環己酮草酰二腙（cuprizone，CPZ）誘導 C57BL/6 小鼠建立的精神分裂癥樣模型小鼠海馬內有髓神經纖維體積改變及其與行為學改變之間的關系。方法：19 只雄性 6 周齡小鼠，隨機分為實驗組（9 只）和對照組（10 只），實驗組用含0.2%（質量分數百分比，w/w）CPZ 的混合鼠飼料飼喂 6 周，建立精神分裂癥樣小鼠模型；對照組用標準鼠飼料飼喂 6 周。運用曠場實驗、高架十字迷宮實驗、Morris 水迷宮實驗、轉棒實驗和探孔實驗測試行為學改變；髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）免疫組化染色及透射電鏡定性觀察髓鞘結構變化；體視學方法測量并計算海馬總體積及海馬內有髓神經纖維體積；統計學方法分析行為學改變與海馬內有髓神經纖維體積改變之間的關系。結果：與對照組相比，實驗組小鼠體質量下降，差異具有統計學意義（P<0.05）；行為學實驗結果表明：實驗組小鼠存在異常的焦慮行為（P=0.018）及空間認知能力障礙（P=0.037），但運動能力（P=0.443）、探索習性（P=0.306）及學習記憶能力未見受損（P=0.462）；MBP 免疫組化染色發現海馬區域免疫陽性染色變淺；透射電鏡定性觀察發現海馬內有髓神經纖維存在脫髓鞘改變；體視學定量測定發現，實驗組小鼠海馬總體積未發生顯著性改變（P=0.955），而海馬內有髓神經纖維體積減�。�P=0.009）；統計學相關分析發現，閉臂路程百分比和海馬內有髓神經纖維體積呈正相關（rs=0.83，P=0.003），開臂路程百分比和海馬內有髓神經纖維體積呈負相關（rs=-0.65，P=0.043）。結論：進一步證實CPZ 模型小鼠可以出現類似精神分裂癥樣癥狀的行為學改變及海馬內有髓神經纖維存在脫髓鞘改變，并且發現海馬內有髓神經纖維體積和行為學表現間具有一定的相關性。

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材料與方法

1.1 動物分組與模型建立

19 只雄性 C57BL/6 小鼠，6 周齡，體質量 17～19 g，實驗

組（9 只）用含 0.2%（質量分數百分比，w/w）CPZ（購于 Sig－ma_Aldrich公司）混合飼料飼喂；對照組（10 只）用鼠標準飼料飼喂；均飼喂 6 周并給與蒸餾水。所有動物均飼喂于相同普通環境并自由攝食和飲水。

1.2 體質量測量

以開始喂食 0.2% CPZ 混合飼料當天記作飼喂第 1 天，并測量動物體質量，以后每 3 d 測量 1 次，觀察 6 周內實驗組和對照組體質量變化。

1.3 行為學測試

在模型制備的第 6 周末，依次進行曠場試驗、高架十字迷宮實驗、Morris 水迷宮實驗（由上海欣軟信息科技有限公司提供）、探孔實驗和轉棒實驗（由重慶醫科大學生命科學研究院提供）。

1.3.1 曠場實驗 實驗前將小鼠置于該行為學測試實驗室，適應環境 60 min。實驗開始時將小鼠放入曠場正中央，記錄每只小鼠在 10 min 內的活動情況。每次實驗結束后，清除糞便，并用 70%酒精擦拭曠場底部及周壁，消除小鼠氣味，避免動物之間相互干擾。

1.3.2 高架十字迷宮實驗 實驗前將小鼠置于該行為學測試實驗室，適應環境 60 min。實驗開始時將小鼠置于高架十字迷宮中央，面朝向其中一個開放臂，記錄每只小鼠在 5 min內的活動情況。每次實驗結束后消除氣味，方法同曠場實驗。1.3.3 Morris 水迷宮實驗 實驗時水池內注入自來水，并加二氧化鈦粉混勻，水溫恒定在 24 ℃左右。第 1 天進行可見平臺實驗，第 2～5 天進行定位航行實驗，2 項實驗中均記錄小鼠逃逸潛伏期（小鼠入水到四肢均爬上平臺的時間）。第 6 天進行空間探索實驗，記錄小鼠穿越平臺次數和平臺所在象限搜尋時間。

1.3.4 探孔實驗 實驗時將小鼠置于探孔實驗儀中央，記錄3 min 和 5 min 小鼠探孔次數。每次實驗結束后消除氣味，方法同曠場實驗。

1.3.5 轉棒實驗 將小鼠置于轉棒儀上，先以 4 r/min 勻速轉動適應 10 min，休息 30 min 后進行測試。測試時采用加速度模式，即在 4 min 內轉棒速度由 4 r/min 均勻增加到 40 r/min。

1.4 標本采集

行為學測試結束后，隨機抽取對照組和實驗組動物各 5只制作大腦標本，步驟如下：（1）麻醉：用 4%水合氯醛（10ml/kg）對小鼠進行腹腔麻醉；（2）灌注固定：經左心室先用生理鹽水約 30 ml 灌注，后用 4%的多聚甲醛約 60 ml 固定后取出大腦，并沿大腦矢狀縫將左右大腦分開，每只隨機抽取1 側大腦半球浸泡于 4%的多聚甲醛溶液，以做免疫組織化學染色；剩余 5 個大腦半球浸泡 2%的多聚甲醛和 2.5% 的戊二醛混合液，以用做體視學分析。

1.5 免疫組織化學染色

常規石蠟包埋法包埋組織塊，切取 4 μm 厚石蠟切片。組織切片經二甲苯脫蠟、枸櫞酸熱修復、30%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶 20 min、封閉血清 37 ℃中水浴 30 min、孵育 MBP 抗體（anti-MBP 1∶500 Covance 公司）4 ℃ 過夜，孵育生物素標記的二抗 37 ℃ 中水浴 20 min、辣根酶標記鏈霉素卵白素 37 ℃中水浴 20 min（以上每步間用 PBS 液漂洗 5 min×3 次）、DAB 顯色、復染后封片，并用顯微鏡拍攝獲得 MBP 染

色照片。

1.6 電鏡標本及電鏡超薄切片的制備與電鏡拍攝

1.6.1 組織切片制備 用 6%瓊脂分別包埋浸泡于多聚甲醛和戊二醛混合液中的左、右大腦半球。冷卻后沿冠狀方向切取 1 mm 厚的連續腦組織切片，每側大腦半球獲得組織切片8~10 片，選取包含海馬的腦組織切片 3、4 片。

1.6.2 電鏡標本制備 在所獲得的含有海馬的大腦切片枕面隨機疊加透明等距測試點，在測試點擊中海馬的地方切取約 1 mm

3的組織塊，每只動物抽取 5 個組織塊。

1.6.3 電鏡超薄切片制備 在 4 ℃條件下用 4% 的戊二醛浸泡并固定海馬組織塊 2 h，并用 0.1 mol/L PBS（pH 7.2）沖洗 3 次，在 4 ℃ 條件下用鋨酸（OsO4）染色 2 h。將組織塊依次置于 50%、70%、90%的乙醇，90%乙醇與 90%丙酮混合物

及 100%丙酮溶液中梯度脫水，然后將脫水后的組織塊浸泡在 100%環氧樹脂 618 中，待組織塊浸透好后，先用球切法將組織塊包埋成直徑為 5 mm 的小球，接著用常規電鏡包埋方法包埋小球。

1.6.4 電鏡照片拍攝 在包埋好的每個組織塊上隨機切取1 張 60 nm 的超薄切片，在透射電子顯微鏡下將每張超薄切片放大 6 000 倍，然后隨機選取 15 個視野進行拍照，每只動物共拍攝獲得 75 張電鏡照片。

1.7 體視學定量分析

1.7.1 海馬體積計算 在解剖顯微鏡下將已制備的 1 mm厚的組織切片放大 10 倍，然后從枕面進行拍照。在所獲得的照片上隨機疊加等距測點框（圖 1），分別計數落在每只動物海馬內的所有測點數 ΣP（H），利用卡瓦列里原理計算海馬總體積：

V（H）= t×a（p）×ΣP（H） （1）式中 V（H）代表每只動物海馬總體積，t 為切片厚度1 mm，a（p）為每一測點代表的面積（0.25 mm2）。

1.7.2 海馬內有髓神經纖維的體積密度與總體積的計算 在拍攝得到的電鏡照片上隨機疊加等距測點框（圖 2），分別計數落在整個海馬內及海馬內有髓神經纖維上的測點數。根據下面的公式

計算海馬內有髓神經纖維的體積分數：VV（nf/H）=∑P（nf）/∑P（H） （2）式中 VV（nf/H）代表海馬內有髓神經纖維的體積密度，∑P（nf）為落在海馬內有髓神經纖維上的測點總數，∑P（H）為落在海馬內的測點總數。根據如下公式計算海馬內有髓神經纖維的總體積：

V（nf，H）= VV（nf/H）×V（H） （3）式中 V（nf，H）代表海馬內有髓神經纖維的總體積，VV（nf/H）代表海馬內有髓神經纖維的體積分數，V（H）代表海馬總體積。

1.8 統計學處理

實驗數據采用 SPSS 19.0 統計分析軟件分析，所列數據均用均數±標準差（x±s）表示。水迷宮實驗中逃逸潛伏期分析采用重復測量方差分析；其余行為學數據、體視學數據均采用獨立樣本 t 檢驗；不滿足正態分布時采用 Mann Whitney U檢驗；相關分析采用 Spearman 相關分析。檢驗水準 α=0.05。

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結 果

2.1 體質量變化

在同一喂養時間點比較對照組和實驗組的體質量差異：喂養第 1 天對照組和實驗組間體質量差異無統計學意義（P >0.05），其余飼喂各天對照組小鼠體質量均高于同期實驗組，并且體質量差異均有統計學意義（P<0.05）（圖 3）。

2.2 行為學變化

2.2.1 曠場實驗 實驗組中央區域爬行時間多于對照組（u=2.083，P=0.037）；實驗組中央區域爬行路程多于對照組（t=-2.820，P=0.018）；2 組小鼠爬行總路程差異沒有統計學意義（t=-0.786，P=0.443）。

2.2.2 高架十字迷宮實驗 實驗組和對照組在閉臂停留時間均多于其在開臂停留時間，2 組進入開臂時間具有統計學差異（t=2.168，P=0.062）；實驗組進入閉臂時間少于對照組（t=

2.398，P=0.029）；實驗組在開臂爬行路程百分比大于對照組（t=2.246，P=0.039）；實驗組在閉臂爬行路程百分比小于對照組（t=3.999，P=0.001）；2 組小鼠進臂總次數差異無統計學意義（t=0.489，P=0.634）；2 組小鼠總爬行路程差異無統計學意義（t=0.148，P=0.885）。

2.2.3 Morris 水迷宮實驗 實驗組和對照組在隱藏平臺實驗中逃逸潛伏期之間差異無統計學意義。撤平臺實驗中對照組和實驗組穿越平臺次數之間差異無統計學意義[（3.85±1.87）次，（4.72±2.03）次，u=0.735，P=0.462]；對照組飼喂天數（d）計算落在海馬內的測點數。以測試點的右上限為計數標準（10×）分別計數落在整個海馬及海馬內有髓神經纖維上的測點數

2.2.4 轉棒實驗 2 組小鼠在棒上爬行時間差異無統計學意義（t=0.953，P=0.354）。

2.2.5 探孔實驗 對照組和實驗組 3 min 探孔次數差異無統計學意義（u=-1.023，P=0.306）；5 min 探孔次數差異無統計學意義（u=-1.144，P=0.253）。2.3 MBP 免疫組織化學染色實驗組較對照組小鼠海馬區域免疫陽性染色改變明顯，海馬區域 MBP 陽性染色幾乎完全消失。

2.4 電鏡照片

對照組小鼠海馬內有髓神經纖維結構致密；實驗組小鼠較對照小鼠組海馬內有髓神經纖維髓鞘板層結構疏松，出現空隙，髓鞘與軸突分離。

2.5 體視學分析

對照組和實驗組海馬體積差異無統計學意義（t=0.058，P=0.955）。實驗組海馬內有髓神經纖維體積分數明顯小于對照組（u=-2.611，P=0.009）；實驗組有髓神經纖維體積明顯小于對照組（u=-2.611，P=0.009）。

精神分裂癥是一種嚴重的慢性精神疾病，全球患病率約 1%。多于青壯年起病，患者存在行為、情感及思維等多種障礙，主要表現為精神活動與環境的不協調。精神分裂癥病因尚未完全闡明，但大量研究表明精神分裂癥患者存在大腦結構的異常，而且這種異常很可能是由大腦發育過程中遺傳因素和環境因素共同作用所致。海馬是邊緣系統的重要組成部分，是精神分裂癥的主要發病腦區。海馬纖維投射復雜而廣泛，被視為大腦的一個信息整合中心，海馬是學習與記憶、情緒及認知功能相關腦區。大腦功能的正常發揮依賴于完整的神經網絡，而髓鞘結構的完整是神經網絡完整的結構基礎之一。海馬髓鞘形成到青春期才完成，而此時期正是精神分裂癥的高發期�？梢姾ｑR髓鞘可能在精神分裂癥的發生和發展中具有重要作用。尸檢研究發現精神分裂癥患者海馬內髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）含量減少。海馬脫髓鞘改變就很可能引起與海馬相關的腦功能障礙。有研究顯示海馬各向異性分數（fractionalanisotropy，FA）值降低在精神分裂癥的早期就已出現而且與認知功能障礙顯著相關。FA 值是彌散張量成像（diffusion tensor imaging，DTI）中用于間接評價髓鞘化程度和纖維完整性的指標，這就進一步提示精神分裂癥中海馬脫髓鞘改變可能與行為學嚴重程度相關。最近比較權威的《精神疾病診斷與統計手冊》（the diagnostic and statistical manual ofmental disorders，DSM）第 5 版（DSM-5）擬提出：采取通過多維度癥狀評估來評價多種精神病理現象及嚴重程度，足見準確評價精神疾病病理表現的嚴重程度及其與行為學表現之間的關系的重要性。然而 DTI 主要是通過測量水分子在各個方向上的運動來間接評價神經纖維束的完整性，對髓鞘微觀結構難以進行直觀和準確的客觀評價；尸檢研究只是定性觀察和髓鞘相關蛋白密度測量等半定量研究，這些研究沒有貫徹隨機抽樣的原則，這些基于二維平面的研究結果與三維空間內的結構參數之間不存在明確的對應關系，因此結果難有說服力。而體視學克服了以上的缺點，能夠準確定量研究有髓神經纖維及髓鞘的相關三維結構參數，從而準確認識髓鞘病理改變的程度及其和行為學表現之間的關系。雙環己酮草酰二腙（cuprizone，CPZ）是一種選擇性銅離子螯合劑，低劑量的 CPZ 可誘導中樞神經系統產生脫髓鞘改變，并伴隨精神分裂癥樣癥狀，同時非典型抗精神分裂癥藥物可以抑制其產生的精神分裂癥樣癥狀，即滿足動物疾病模型的 3 個判斷標準，而作為精神分裂癥樣模型。此模型中出現了海馬內有髓神經纖維的脫髓鞘改變，并且低劑量飼養 6 周對海馬神經元幾乎無影響。因此本實驗用 0.2% CPZ 誘導建立精神分裂癥模型，用體質量檢測、行為學測試、免疫組化和電鏡觀察鑒定模型的可靠性，并在此基礎上應用體視學方法定量

2.6 體視學和行為學陽性指標間的相關分析

對上述行為學實驗中差異具有統計學意義的行為學參數和體視學參數進行相關分析。

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討 論

精神分裂癥病因尚未完全闡明，其臨床表現的異質性很強，因此迄今為止還沒有建立一個能夠得到廣泛認可的精神分裂癥動物模型。目前研究中使用的動物模型都只可表現出某一些精神分裂樣癥狀及某種病理改變。本實驗所選用低劑量 CPZ 動物模型主要病理改變為中樞神經系統脫髓鞘改變。該模型小鼠存在如社交障礙、前脈沖抑制等較特異的精神分裂癥樣行為學改變，非典型性抗精神分裂癥藥物可改善其癥狀，是一個較為成熟并得到廣泛應用的精神分裂癥樣動物模型。有研究表明該模型在不同誘導時間點各腦區脫髓鞘程度不同，如胼胝體在 4.5~5.0 周、皮質和海馬在 6 周脫髓鞘程度達到最大，因此本研究選用 6 周 0.2% CPZ模型，以觀測該模型小鼠在海馬脫髓鞘可能最嚴重時的行為學表現，并進一步準確定量研究海馬髓鞘的相關參數及其和行為學改變間的關系。本實驗通過體質量觀察、行為學檢測、MBP 免疫組化染色和透射電鏡照片分析等方法對所制備動物模型進行可靠性鑒定。在動物模型制備整個過程中，實驗組小鼠體質量出現了下降，與以往研究相符。以往研究表明 0.2% CPZ 造模 6 周小鼠出現曠場實驗中央區域路程增加的行為學變化。有研究顯示曠場實驗的中央區域爬行路程是反映動物的情感性行為學的指標。本實驗中實驗組小鼠出現了曠場中央區域爬行路程增加。高架十字迷宮行為學測試結果與曠場實驗結果相似，進一步證實實驗組小鼠存在異常行為學表現。但實驗組小鼠運動能力及探索習性均未發生改變，這說明本實驗中小鼠異常的行為學表現并不是由于運動能力和探索習性的改變所造成的，而可能是由于實驗組小鼠空間認知能力受損所造成的，因為曠場實驗中央區域時間用來反映嚙齒類動物的空間認知能力，本實驗中該指標實驗組明顯高于對照組。曠場實驗中的中央區域和高架十字迷宮中的開臂環境對小鼠來說均存在潛在的威脅，正常小鼠會因害怕而盡快避開，而本實驗中實驗組小鼠在具有潛在威脅的危險環境中活動明顯增加，出現在危險環境中焦慮遲鈍的異常情感表現，這與精神分裂癥病人出現的以行為與環境不協調為主的特征表現非常相似。由此可見本實驗中出現的行為學變化不僅說明本研究所制備的動物模型具有可行性，而且也為 0.2% CPZ 模型可作為精神分裂癥動物模型提供了強有力的證據。模型小鼠行為學結果結合 MBP 免疫組化染色及電鏡下髓鞘微觀結構的變化，說明本實驗動物模型構建成功且可靠。

雖然精神分裂癥病因未明，但精神分裂癥存在神經發育異常，并且基因和環境的共同作用在其發生發展中具有重要作用，已得到研究者的認可。海馬在環境應激調節中具有重要作用，多種與精神分裂癥相關基因在海馬內高表達，足見海馬在精神分裂癥病因研究中的重要價值；髓鞘形成從出生前開始一直延續到出生后，海馬髓鞘形成到青春期才完成，而此時期正是精神分裂癥的高發期；說明明確海馬髓鞘的病理改變對探討精神分裂癥病因具有非常重要的意義。尸檢研究發現精神分裂癥患者海馬內 MBP 含量減少，體視學的定量研究進一步證實精神分裂癥患者海馬后部少突膠質細胞數量減少，眾所周知少突膠質細胞是中樞系統髓鞘形成細胞，因此以上的研究提示精神分裂癥患者存在海馬髓鞘結構破壞和髓鞘形成障礙即脫髓鞘改變�；�因組學研究發現精神分裂癥患者海馬少突膠質細胞和髓鞘相關基因表達異常，進一步說明海馬脫髓鞘改變可能是精神分裂癥的病理學基礎之一。最近比較權威的精神疾病診斷標準 DSM-5提出：擬采取通過多維度癥狀評估來評價多種精神病理現象及嚴重程度，可見對海馬脫髓鞘這一病理改變客觀準確定量的必要性，然而目前研究不論是活體、尸體還是動物模型研究，都無法提供精神分裂癥中海馬脫髓鞘改變的準確定量數據。主要原因如下：（1）針對活體研究：DTI 是目前用于活體腦白質主要纖維束檢查的唯一影像學方法，對神經纖維的細微結構改變敏感，可觀察神經纖維束結構及走行，其中 FA 值降低提示髓鞘結構改變和神經纖維完整性受損。雖然有研究發現精神分裂癥患者額葉、顳葉、海馬等腦區及胼胝體、前扣帶、鉤束等存在連接各腦區的神經纖維束 FA 值降低，為精神分裂癥存在連接障礙提供了解剖學證據，但 DTI 也存在如下的缺點：首先 FA 值主要適用于研究較大的神經纖維束，而海馬是以灰質為主的腦結構，海馬內神經纖維束細小，尤其是海馬內有髓神經纖維含量較少，因此 DTI 對其測量的可靠性較低；其次 DTI方法主要是通過神經纖維等結構對水分子運動的限制使得其更傾向于沿腦白質走行方向彌散的原理間接反映髓鞘化程度，因此其不能直接客觀地觀察到有髓神經纖維髓鞘超微結構的改變，更無法對髓鞘結構做到準確的定量。（2）針對尸體和動物模型研究：以往對精神分裂癥尸體研究多為髓鞘主要結構蛋白，如 MBP 密度測量等的半定量研究；雖然有研究人員運用免疫組化染色方法發現 CPZ 小鼠模型可出現大腦多個腦區脫髓鞘改變，其中包括海馬；并運用免疫組化化學染色的方法在不同時間點比較海馬脫髓鞘程度，發現在 CPZ 誘導 6 周海馬脫髓鞘程度達到最大；但這些研究沒有貫徹隨機抽樣的原則，而密度研究也存在參照空間陷阱問題，沒有能夠在三維空間內對有髓神經纖維進行準確定量，因此結果很難具有說服力，而體視學方法克服了以上的缺點，能準確測量并定量有髓神經纖維及髓鞘的相關三維結構參數。本實驗中電鏡定性觀察發現實驗組小鼠海馬髓鞘出現分層和髓鞘與軸突的分離等現象及有髓神經纖維直徑減小等脫髓鞘改變，進一步運用體視學方法測量發現海馬內有髓神經纖維體積減少了約 77%，這一結果更加準確客觀的說明 CPZ 模型存在海馬的脫髓鞘改變。髓鞘是包繞在軸突表面的脂質成分，主要起絕緣和加速神經傳導的作用。神經纖維直徑、髓鞘厚度均可影響神經信息的傳導速度，因此脫髓鞘改變就可能引起傳導速度的下降，而導致神經元協調刺激的能力受損，進而引起遞質釋放的異常，并最終引起大腦功能的異常而出現行為學改變。有證據證實白質纖維髓鞘厚度下降可導致神經傳導速度減慢，引起多巴胺釋放異常，進而出現類似精神病癥狀的行為改變；另外，脫髓鞘疾病出現了精神分裂癥樣癥狀，如多發性硬化癥、異染性腦白質營養不良；抗精神病藥物可通過調節髓鞘形成相關蛋白表達而改善精神分裂癥樣癥狀，說明脫髓鞘改變很可能在精神分裂癥樣癥狀表現中具有重要作用。臨床研究發現 FA 值的降低和臨床癥狀之間存在一定的相關性，比如：精神分裂癥有幻聽癥狀的患者其弓狀束FA 值的降低與幻覺呈顯著正相關；精神分裂癥中海馬 FA 降低和認知功能障礙顯著相關，提示不同腦區神經纖維完整性受損嚴重程度和該腦區相關的行為表現有關。眾所周知海馬和焦慮有關，有研究表明大鼠海馬腹側損傷可出現在高架十字迷宮中焦慮遲鈍的行為表現，這與本實驗中實驗組小鼠在該實驗中行為表現非常相似，綜合以上的研究結果說明海馬脫髓鞘改變很可能與焦慮樣行為表現有關。因此本研究將評價脫髓鞘改變的體視學參數和行為學測量指標相結合進行了統計分析，發現高架十字迷宮中開臂、閉臂爬行路程均和海馬內有髓神經纖維髓鞘體積存在相關性，為精神分裂癥中存在海馬脫髓鞘改變提供了強有力的證據；也為通過癥狀評估精神疾病病理改變的嚴重程度提供了一定的理論依據。本研究采用了多種行為學方法檢測了 CPZ 模型中小鼠的行為學表現，證實 CPZ 模型是良好的精神分裂癥樣模型；首次采用了三維體視學定量方法測定了 3 月齡 C57BL/6 正常及 CPZ 誘導 6 周的脫髓鞘小鼠海馬體積及海馬內有髓神經纖維髓鞘體積，為今后的針對該動物及該動物模型的研究提供了準確、可靠的定量數據；明確海馬內有髓神經纖維體積與行為學改變間具有相關性，為今后通過外顯行為判斷大腦結構病理改變提供了一定的理論依據。但是對于海馬在脫髓鞘后出現不同行為學改變的具體機制及引起海馬內有髓神經纖維體積改變的具體原因等仍然不清楚，有待進一步研究。