標題HPLC法在藥物對映體的分離和測定中的應用

摘要：由于藥物對映體之間在藥理、毒理及吸收等方面存在較大差異，因此，建立分離和測定對映體化合物的方法十分重要。本文綜述HPLC法在分離和測定藥物對映體的常用方法，包括手性衍生化試劑、手性流動相和手性固定相在藥物對映體分離測定中的應用。對對映體化合物的分析鑒定有指導意義。

　　手性化合物的拆分是當前分析化學中最為活躍的領域之一，自然界中的許多化合物都是有旋光性的，而合成手性藥物中大多（88%）是外消旋體，許多手性藥物的對映體在生理過程中顯示了不同生理活性。據研究反應停的致畸作用主要是由于其（S）-（-）異構體所致。因此，建立高專屬性、高靈敏度、高分離度的對映體拆分和測定方法，對提高藥物的活性、減小副作用，深入研究藥物的作用機理等具有重要的理論和實際意義。

　　對映體化合物之間除對偏振光的偏轉方向不同外，具有完全相同的理化性質，因而其分離比較困難。傳統的拆分方法有分步結晶、微生物和酶消化法等，或者用手性衍生化試劑將其轉化成非對映體，然后根據其物理性質不同進行分離，但這些方法難于進行微量的分離和測定。80年代以來，隨著快速、準確、微量的光學異構體的HPLC拆分及測定方法的建立和發展，使HPLC迅速成為藥物對映體分離和測定最為廣泛應用的方法。

　　手性HPLC拆分法是以現代HPLC技術為基礎，引入手性環境使對映異構體間呈現物理特征的差異而進行分離。通常分間接法和直接法，前者是對映體混合物以手性試劑作柱前衍生，形成一非對映體，然后以常規（偶也見手性）固定相分離。后者是直接以手性流動相（CMP）或手性固定相（CSP）直接進行分離。

　　1、手性衍生化試劑法

　　手性衍生化試劑（CDR）法是在分子間引入手性中心，其產物為非對映異構體（diastereomer，DSTM），從而進行分離。

　　下列情況通常選用CDR法進行拆分：（1）不宜直接拆分。添加某些基團，以增加色譜系統的選擇性。如游離胺類在CSP上往往是頗弱的色譜性質，生成中性化合物后則獲顯著改善。（2）提高紫外或熒光檢測的效果。劉雁鳴等用NBD-（L）-APY熒光試劑柱前衍生化測定布洛芬對映體，提高了檢測靈敏度。對CDR的要求通常為：溶質分子至少有一個（多個時其性質各不相同）功能團供衍生（多為-NH2，-OH或-COOH）。光學活性試劑必需是手性高純度；反應條件必須溫和、簡便；宜附有發色或熒光基團。

　　目前，已有許多商品化的CDR可供選用，常見的CDR可分為以下幾類：（1）異硫氰酸酯和異氰酸酯類此類試劑易與大多數醇類及胺類化合物反應進而被分離，如麻黃素類，腎上腺素類，腎上腺素拮抗劑，兒茶酚胺類等。王亞芹等采用S（ ）-1-（1-苯基）乙基異氰酸酯為衍生化試劑分析了血漿中普羅帕酮的對應體，并研究了其在健康人體內的藥代動力學。邱宗蔭等用乙酰葡萄糖異硫氰酸酯（GITC）為柱前CDR，以反相HPLC法測定血漿中地佐西平對映體的血藥濃度，線性范圍為5～200μg.L-1。陳冰等用GITC為柱前CDR，用反相HPLC法測定血漿中普羅帕酮對映體的血藥濃度，適合用于臨床藥動藥效學研究。（2）萘衍生物類由于此類化合物有利于提高立體選擇性和檢測靈敏度，因此萘的各種衍生物用作手性試劑十分普遍。Wainer等選用萘甲醛（NDH）為手性試劑，與其縮合成惡唑烷衍生物，成功地分離了麻黃堿、4-甲氧基麻黃堿、偽麻黃堿。Bhatti等用S-（ ）-1-（1-萘基）-乙基異氰酸酯為CDR，用HPLC法測定了人血漿中美托洛爾對映體濃度。（3）酰氯與磺酰氯類此類試劑可與化合物直接縮合，或與樣品反應后，再引入其它基團，合成更有利于拆分與檢測的衍生物。Sallustio等以SOCl2與芳丙酸類消炎鎮痛藥如2-苯丙酸、酮洛芬及非諾洛芬的血漿樣品提取物反應，然后再與R-2-苯乙胺成酰胺衍生物，產物以NP（Sil，乙腈∶二氯甲烷，5∶95）分離，異構體均可完全拆分。（4）光學活性氨基酸類為最早采用的色譜手性試劑，為提高反應活性和定量回收率，常將羧基轉化成酰氯、酸酐等。此類試劑廣泛用于胺、羧酸及醇類藥物，尤其是氨基酸類，其衍生化法多基于肽合成原理。

　　本類方法要求手性藥物具有活潑反應基團，同時兩個對映體的衍生化速度應相同，否則會引起非對映體與原對映體的組成產生差異，另外要求手性衍生化試劑光學純度高，反應要迅速、徹底，因此應用受到一定限制。

　　2、直接方法

　　直接方法是在分子間引入手性環境，即采用手性流動相或手性固定相不經柱前衍生化直接分離藥物對映體的方法，該法近年發展迅速。

　　2.1 手性流動相拆分法向流動相中加入一手性試劑，它與溶質常以氫鍵、離子鍵或金屬離子的配位健生成非對映體締合物，從而以常規HPLC固定相分離。分離機理為：（1）在流動相中形成立體選擇性復合物；（2）手性流動相添加劑（CMPA）與固定相之間發生作用，形成動態的CSP，該法可通過改變CMPA的種類、濃度及流動相的組成而優化分離條件。

　　常用的CMPA主要有：（1）環糊精類主要是α-、β-和γ-環糊精及其衍生物。Eto等用β-環糊精測定了數種巴比妥類和乙內酰脲類藥物在生物體液中的對映體濃度。謝劍煒等用β-環糊精手性流動相添加劑，用反相HPLC法首次抗膽堿能藥物鹽酸戊乙奎醚、鹽酸苯環壬酯和鹽酸卡馬特靈，3個手性藥物4對對映體完全達到基線分離。（2）手性離子對試劑，karlsso等以N-苯甲酰甘氨酰脯氨酸作為CMPA，分離測定了血漿中（R）-和（S）-普萘洛爾。與HPLC中的離子對法的差別主要在于前者是手性離子對試劑，由于CMPA價格昂貴，其體系穩定性差等原因，應用受到一定的限制。范柏等用L-苯丙氨酸為配合劑，Cu2 為配合離子，用簡便的手性配合交換反相HPLC法成功拆分了氧氟沙星對映體，手性流動相為6mmol.L-1L（D）-苯丙氨酸，3mmol.L-1硫酸銅-甲醇（83∶17）。

　　2.2 手性固定相拆分法由于CSP技術的飛速發展，采用CSP分離對映體化合物的方法應用越來越廣泛。目前，商品化的手性柱已有數十種，卻無一具有類似ODS柱那樣普遍的適應性，且價格昂貴。隨著手性識別機理的深入研究，新方法、新理論不斷提出，預計將會有價廉、適應性廣的CSP面世。（1）環糊精鍵合相α-、β-和γ-環糊精（CD）是分別由6～8個葡萄糖單位通過α-（1、4）連接構成的環狀低聚糖，CD-CSP通過共價鍵將CD分子鍵合到硅膠上，形成對水穩定的鍵合相。β-CD鍵合相的立體選擇性較好，應用最多。β-CD柱上分離較好的化合物通常其手性中心為分子中環狀結構的一部分，或至少與兩個SP2雜化碳原子相連。Berthod等采用商品的β-CD柱（CydobondⅠ）和γ-CD柱（CydobondⅡ）拆分了25種不同類型的手性藥物，其中對映體之間達基線分離的有11種。（2）吸附絡合物形成相要想實現手性識別，手性化合物與CSP之間至少應存在三種相互作用，稱為三點識別模式。這些作用可以是氫鍵、靜電作用、疏水作用、π-π作用、偶極-偶極作用或空間作用，一般通過將某些氨基酸，如（R）-或（S）-苯基甘氨酸等分子中的α-氨基與3，5-二硝基苯甲酰氯反應后，離子或共價鍵合到氨丙基硅膠上而制得。該類固定相通常按正相方式操作，其在藥物分析中應用較少，后來，RUSTUM等發現也可使用反相分離系統，從而擴展了其應用范圍。（3）手性聚合物相用不同方法將纖維素衍生物涂復于大孔硅膠上而制得，在此類固定相上得到成功分離的化合物大都含有苯基、羰基、腈基、磺�；�或羥基等。目前，纖維素—三（3.5一二甲基苯基氨基甲酸酯）手性固定相應用較多。例如，用三（3，5-二甲苯基氨基甲酸酯）纖維素衍生物為CSP對血漿中普萘洛爾對映體的測定。Shibukawa等人采用3，5-二甲苯基氨基甲酸酯衍生化的直鏈淀粉手性固定相（AD-CSP）分離了維拉帕米及其代謝產物去甲維拉帕米的對映體，方法的線性范圍為2.5～100μg.L-1。（4）蛋白質鍵合相以離子鍵（或共價鍵）和蛋白交聯作用將蛋白質固定于硅膠上，利用蛋白質分子與手性化合物分子間的立體選擇性作用，進行藥物對映體分離，其機理一般有氫鍵、靜電作用、疏水作用、離子對和離子交換作用。將α1-酸性糖蛋白（α1-AGP）固定到硅膠上而制得AGP柱可直接分離許多堿性、酸性及中性藥物對映體。鐘大放等用CHIRAL-AGP柱，選擇不同流動相分別拆分了SFZ-47、KMBZ-009和地丙苯酮3種藥物的4對對映體，并研究了SFZ-47在家犬體內的藥代動力學。Schmidt等人以α1-酸性糖蛋白為CSP測定人體血漿中美沙酮對映體的含量。Orn等以α1-酸性糖蛋白為CSP可使α2-拮抗劑medetomidine-HCl對映體在8min內實現基線分離。

　　由于光學異構體往往存在生物活性的巨大差異，因此，對映體拆分研究的最大受益者可以說首選藥學，在研制含手性中心的新藥過程中，也應分別評價單個對映體的效能、毒性及藥動學性質。隨著高效，簡便快速，易于自動化的手性藥物分析技術的發展，必將把手性藥物的鑒定、研究及其質量控制和生產推進至一個嶄新的發展時期。