標題高效液相色譜法測定山楂果實中槲皮素的含量

【摘要】目的建立高效液相法測定山楂中槲皮素含量的方法。方法色譜條件：Shim-PackVP-ODSC18柱，流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液（52∶48,V/V），檢測波長為373nm。結果槲皮素的回歸方程為Y=2855.4X-10974（r=0.9999，n=5），線性范圍為0.0189～0.0566μg；平均回收率為96.44%，RSD為1.51%。結論此法簡便、結果可靠，為山楂藥材的質量控制提供快速準確的測定方法。
　　
　　【關鍵詞】山楂槲皮素 高效液相色譜法 含量測定
　　
　　山楂為常用中藥,具有消食健胃和行氣散淤的功效,其主要成分為黃酮類和有機酸類化合物［1］。山楂可降壓、降血脂、增加冠脈流量、強心和抗心律不齊，有效成分為黃酮類化合物［2］，其果實主要成分為槲皮素和金絲桃苷［3］。目前,《中國藥典》僅測定了其有機酸（以枸櫞酸計）的含量，并未對黃酮類成分槲皮素的含量測定法進行規定。本文參閱文獻［4~6］用反相高效液相法對山楂果實提取物中的槲皮素進行了含量測定方法學的研究。結果表明,該測定方法準確、靈敏、重現性好,獲得了滿意的結果。為建立山楂果實中槲皮素的含量測定方法,制定山楂中槲皮素的含量限度,進一步完善山楂的質量標準提供參考。
　　
　　1儀器與試藥
　　
　　電子分析天平（AUW220D,SHIMADZU）；CQ2500型超聲波清洗器（上海必能信超聲有限公司）；恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；UV-2450型紫外可見分光光度計（SHIMADZU）；高效液相色譜儀（日本島津公司）：LC-10ATvp泵，SPD-10Avp紫外檢測器，CTO-10ASvp柱溫箱，HW色譜工作站。藥材山楂（市售，經南京醫科大學藥學院天然藥物化學與生藥學教研室陳立娜博士鑒定）；槲皮素對照品（中國藥品生物制品檢定所，含量測定用，批號10081-9905）；甲醇（色譜級），去離子水（南京醫科大學分析測試中心提供），磷酸（分析級）。
　　
　　2方法與結果
　　
　　2.1色譜條件色譜柱為Shim-packVP-ODSC18柱（150mm×4.6mm,5μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液（52∶48）；流速0.8ml/min；檢測波長373nm；柱溫30℃；進樣量10μl。
　　
　　2.2對照品溶液的制備精密稱取在105℃干燥至恒重的槲皮素對照品適量，加甲醇制成每毫升含槲皮素4μg的溶液，作為對照品溶液。
　　
　　2.3供試品溶液的制備取藥材粉末約1.1g,精密稱定，置錐形瓶中,加入甲醇40ml,25%鹽酸溶液5ml搖勻,超聲處理20min,移置水浴中加熱回流2h，迅速冷卻至室溫,甲醇定容至50ml量瓶中,搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。取對照品溶液、供試品溶液于上述色譜條件下進樣，得HPLC圖譜（見圖1），分析得系統適用性實驗結果。見表1。
　　
　　圖1HPLC圖（略）
　　
　　表1系統適用性實驗結果（略）
　　
　　2.4線性范圍的考察分別精密吸取槲皮素對照品溶液（3.8μg/ml）5.0，7.5，10.0，12.5，15.0μl，依次注入液相色譜儀，按上述色譜條件，分別進行分析，測定其峰面積值，并以對照品量（X）為橫坐標，峰面積值（Y）為縱坐標，得槲皮素回歸方程：Y=2855.4X－10974（r=0.9999，n=5）。結果表明：槲皮素對照品在0.0189～0.0566μg范圍呈成良好的線性關系。
　　
　　2.5進樣精密度實驗精密吸取槲皮素對照品溶液10μl，連續進樣6次，測定峰面積值，計算RSD=0.35%。
　　
　　2.6溶液穩定性實驗取供試品溶液，每隔1h時進樣、測定一次，結果表明：供試品溶液在所測的4h內測得的結果基本一致，槲皮素的RSD=1.27%。
　　
　　2.7重復性實驗取同一批號樣品6份，按供試品溶液制備項下方法制備并測定，結果槲皮素含量為山楂果實生藥量的0.0132%。
　　
　　2.8回收率實驗取已知槲皮素含量（0.0132%）的樣品6份，每份約0.65g，分別精密加入槲皮素對照品溶液（0.0850mg/ml）1ml，按供試品溶液制備項下方法制備并測定，結果平均回收率為96.44%，RSD為1.51%。
　　
　　2.9樣品含量測定按“2.3”項下方法制備3批市售山楂藥材供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液，按上述色譜條件測定，以外標法計算含量。結果見表2。
　　
　　表2樣品中槲皮素含量測定結果（略）
　　
　　3討論
　　
　　實驗中分別采用了甲醇-0.4%磷酸溶液，甲醇-0.2%磷酸溶液兩個不同的流動相系統進行實驗，當將甲醇-0.4%磷酸溶液系統調整為（52∶48）時，不僅分離效果好，靈敏度較高，且大大縮短了待測組分的保留時間（與文獻［4,5］相比）。故最后選擇甲醇-0.4%磷酸溶液（52∶48）為本實驗的流動相系統。
　　
　　另外，本實驗供試品溶液的制備方法與文獻［4］的方法相比較簡單，所提得待測組分的含量是文獻［4］報道的2.3倍。
　　
　　本文考察了3批不同批次山楂藥材中槲皮素的含量。建立了一種更準確、簡單、快速的HPLC測定方法，對于評價山楂藥材及其制劑的質量提供了更為有效的方法。