標題熒光光度法研究微乳介質中丹參酮ⅡA與牛血清白蛋白的相互作用

【摘要】目的研究微乳介質中丹參酮ⅡA和牛血清白蛋白的相互作用行為。方法采用熒光光度法，通過Stern�睼olmer公式計算熒光猝滅數據和結合常數，通過計算熱力學數據探討丹參酮ⅡA和牛血清白蛋白的相互作用機理。結果常溫下結合常數為1.93×104L·moL-1，且結合常數、猝滅常數均隨溫度升高而降低，熱力學數據ΔH0、ΔS0和ΔG0均為負值。結論在微乳液中，丹參酮ⅡA對牛血清白蛋白的猝滅機制屬于復合物的靜態猝滅過程，其結合機制可能為范德華力和氫鍵作用力。
　　
　　【關鍵詞】丹參酮ⅡA;牛血清白蛋白;微乳液;結合力
　　
　　藥物小分子與生物大分子相互作用的研究是化學和生命科學熱門課題之一。研究血清蛋白質與內源性化合物及藥物相互作用的方法有熒光光譜法[1]、電化學法[2]、平衡透析法[3]、液相色譜法[4]和毛細管電泳法[5]等。作者曾用紫外分光光度法研究了微乳體系中丹參酮ⅡA（tanshinoneⅡA,Tan�并駻）和牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA）的相互作用，結果表明，微乳液可以做為脂溶性藥物Tan�并駻和水溶性大分子BSA的共溶劑，并且二者在這樣一個體系中有相互作用[6]。本文通過熒光光度法進一步證明了Tan�并駻和BSA在該體系中的相互作用，并研究了其作用機理。
　　
　　1儀器與試劑
　　
　　UV��2450型紫外分光光度計（日本島津）;F��2500型熒光分光光度計（日本日立）;Orion828型酸度計（美國奧立龍）;HH��2恒溫水浴鍋（金壇市宏華儀器廠）。
　　
　　牛血清白蛋白（BSA,相對分子質量67000,分析純,上海生物技術有限公司），1.08×103mol/L的水溶液，于4℃冰箱中保存;丹參酮ⅡA（對照品，西安冠宇生物技術有限公司），2.51×10-3mol/L的95%乙醇溶液;冰乙酸�擦姿岐才鹚岐矚溲趸�鈉的B�睷緩沖溶液。其他化學試劑均為分析純;實驗用水為蒸餾水。
　　
　　按照文獻[7]方法配制微乳液。微乳液配比組成見表1。表1微乳液的成分配比及結構
　　
　　2實驗方法
　　
　　用含水50%、pH值為7.24的微乳液作為共溶體系，固定BSA濃度在1.5×10-5mol/L，變化藥物濃度范圍10×10-6～200×10-6mol/L。充分混合均勻，20℃下靜置過夜至完全平衡。在波長283nm的激發光下，熒光分光光度計掃描3個溫度（293K、298K和303K）時BSA在290～500nm范圍內的發射光譜。激發光和發射光狹縫寬度均為5nm。
　　
　　3結果與討論
　　
　　3.1微乳體系的確定
　　
　　實驗結果表明十二烷基*鈉�舱�丁醇�舱�庚烷�舱麴s水微乳體系穩定，對藥物的紫外光譜沒有影響。不同含水量微乳液Tan�并駻和BSA的溶解度實驗表明:含水量10%～30%的微乳液可溶解Tan�并駻，但使BSA沉淀;含水量70%～90%的微乳液可溶解BSA，但使Tan�并駻沉淀;含水量40%～60%的微乳液可同時溶解Tan�并駻和BSA。因此本文選擇含水量為50%的微乳液作為溶劑體系。
　　
　　另外，為選出能同時溶解藥物和BSA的最適宜的微乳液，對非離子活性劑80�舱�丁基酒精�舱�戊烷�菜�和十二烷基*鈉�舱�丁基酒精�舱�庚烷�菜�組成的兩種微乳液的吸收光譜分別進行了測試。結果顯示由十二烷基*鈉�舱�丁基酒精�舱�庚烷�菜�組成的微乳液經振蕩并放置一段時間待其穩定后對光譜沒有什么影響。而在超聲波下制備的非離子活性劑80�舱�丁基酒精�舱�戊烷�菜�和十二烷基*鈉�舱�丁基酒精�舱�庚烷�菜�組成的微乳劑系統都不穩定，而且在藥物光譜上顯示有很多雜質峰。
　　
　　3.2不同介質中BSA的熒光光譜
　　
　　分別掃描在B�睷緩沖溶液中和在pH7.24的微乳液中的BSA的熒光光譜，結果見圖1。比較B�睷緩沖溶液和微乳液中BSA的熒光發射光譜可見（λem=338nm,F=1070），在微乳中的BSA的最高峰藍移到332nm。熒光強度減弱到643，這可能歸因于微乳溶液的低界面張力和低黏度。
　　
　　3.3熒光法測定Tan�并駻和BSA在微乳液中的結合行為
　　
　　化合物的熒光強度可能因為某些分子的結合而降低，測定大分子的熒光性質可以得到小分子與蛋白結合的信息，如結合機理，結合方式，結合常數等。
　　
　　記錄283nm激發光下290～500nm波長范圍內，BSA與不同濃度的Tan�并駻反應后的熒光光譜，見圖2。圖2顯示隨著Tan�并駻濃度的增加BSA的內源熒光強度有規律地降低，且峰形均基本不變，說明Tan�并駻對BSA的熒光有猝滅作用。通過Stern�睼olmer公式：F0/F=1 KSV[Q]計算熒光淬滅數據，式中F0為淬滅劑不存在時的熒光強度，F為加入淬滅劑后的熒光強度，Ksv是Stern�睼olmer淬滅常數，[Q]是淬滅劑濃度。在不同的溫度下Ksv和R2的值見表2，Stern�睼olmer圖是線性（圖3）和向上傾斜的，表明Tan�并駻結合BSA的淬滅機制可能是靜態淬滅過程，因為Ksv值隨溫度的升高而降低，如果是動態淬滅會出現相反的現象。
　　
　　Tan�并駻與BSA結合的信息可以通過計算熒光淬滅速度常數Kq得到進一步確定。Kq用下式計算：Kq=Ksv/τ0,τ0是沒有猝滅劑時蛋白質的熒光平均壽命，生物高聚物τ0值是10-8s-1[8]，因此Kq值是1012L·mol-1·s-1數量級，比最大散射碰撞淬滅常數2×1010L·mol-1·s-1大。這顯示淬滅不是由動態的碰撞開始的而是與化合物的分子結構有關[9]。表2根據Stern�睼olmer曲線得淬滅常數
　　
　　3.3Tan�并駻和BSA的結合常數以及相互作用力類型
　　
　　當小分子結合大分子，結合常數和結合的位置數目可從下面的方程式得出[10]：
　　
　　logF0-FF=logK nlog[Q]
　　
　　式中，K為結合常數，n為結合位點的數目。用log（F0-F）/F和log[Q]的點作圖能算出K和n，結果見表3。從表3可見，結合常數隨著溫度的升高而降低，其結果是導致Tan�并駻�睟SA復合物的穩定性降低;同時，從n的數據也可以推斷出BSA對Tan�并駻是一個單獨級別的結合位點。表3Tan�并駻和BSA的結合參數和熱力學參數
　　
　　通過分析與溫度相關的熱力學參數可以進一步說明BSA和Tan�并駻之間的作用力類型。小分子和大分子作用力主要含有氫鍵、范德華力、靜電力、疏水力等。從熱函的改變（ΔH0），熵值改變（ΔS0）和自由能的改變（ΔG0），可以判斷結合方式。熱力學參數可用下面的方程式計算:
　　
　　logK=-ΔH02.303RT ΔS02.303R
　　
　　ΔG0=ΔH0-TΔS0
　　
　　K和R分別是結合常數和氣體常數，結果見表3。
　　
　　從表3可見，ΔG0≤0，說明Tan�并駻和BSA的結合是自發的過程。負的ΔH0和ΔS0一般被認為是在低電解質液中范德華力和氫鍵結合的證據，靜電力相互作用中負的ΔH0值也可能扮演一定的角色[11]。但這與BSA和Tan�并駻分子結構分析不一致，在pH=7.24時，它們都帶負電荷[12]。因此推斷，在微乳液中Tan�并駻與BSA之間的結合方式可能是氫鍵和范德華力。
　　
　　4結論
　　
　　本文以微乳液為共溶體系，用熒光分光光度法研究了脂溶性藥物分子丹參酮ⅡA與BSA的結合作用，用Scatchard方程計算了二者的結合常數，結合常數為1.93×104L·mol-1，該結果與文獻[6]的研究結果基本一致。通過熱力學參數的計算推得微乳液中丹參酮ⅡA對BSA的猝滅機制屬于復合物的靜態猝滅過程，其結合機制可能為范德華力和氫鍵作用力。