標題免疫熒光技術（immunofluorescence technique）

免疫熒光技術（immunofluorescence technique）是一種以熒光物作為標記物的免疫分析技術，熒光物質分子在特定條件下吸收激發光的能量后，分子呈激發態而極不穩定，其迅速回到基態時，可以電磁輻射形式釋放出所有的光能，發射出波長較照射光長的熒光。用熒光素與已知的抗體（或抗原，較少用）結合，但不影響其免疫活性，然后可將熒光素標記的抗體作為標準試劑，用于檢測和鑒定未知的抗原。在熒光顯微鏡下可以直接觀察呈現特異熒光的抗原抗體復合物。

常用的熒光素主要有：

1 ．異硫氰酸熒光素 （FITC） ，最大吸收光譜為 490~495nm ，最大發射光譜為 520~530nm ，呈黃綠色熒光。

2 ．四乙基羅丹明 （RB200） ，最大吸收光譜為 570nm ，最大發射光譜為 595~600nm ，呈明亮橙色熒光。

3 ．四甲基異硫氰酸羅丹明 （TRITC） ，最大吸收光譜為 550nm ，最大發射光譜為 620nm ，呈橙紅色熒光。

一、 FITC 標記抗體技術

在堿性條件下， FITC 的異硫氰酸基在水溶液中與免疫球蛋白的自由氨基經碳酰氨化而形成硫碳氨基鍵，成為標記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。

目前一般實驗使用的熒光抗體多為商品化試劑，不需自己合成。

二、熒光抗體染色法

實驗原理

熒光抗體染色技術的基本原理是利用抗原抗體特異性結合的特點，用標記有熒光素的熒光抗體檢測待檢抗原樣本，如形成抗原抗體復合物，則其在藍紫光或紫外光照射下發出熒光，用熒光顯微鏡進行觀察。本實驗常用于測定細胞表面抗原和受體，各種病原微生物的快速檢查和鑒定，組織內抗原的定性和定位研究以及各種自身抗體的檢測等。經典的熒光抗體技術包括直接法、間接法和補體法。

實驗材料

1 ．抗原 呼吸道合胞病毒 （RSV） （或待檢標本）

2 ．細胞 Hep-2 （或 Hela ）細胞單層

3 ．熒光抗體 1:40 抗 RSA IgG-FITC 標記物； 1:40 抗兔 IgG-FITC 標記物

4 ．中間抗血清 1:200 兔抗 RSV 免疫血清 （Abt）

實驗方法

1.制備抗原片

⑴ RSV 感染細胞：用 RSV 感染 Hep-2 或 Hela 細胞單層培養物，在細胞未出現 CPE 前，用胰酶消化使分散，并配制成 4-6 ′ 10 5 個 /ml 的細胞懸液，用吸管將細胞懸液滴加到 10 點鍍膜玻片上，每個圓點上約 0.025ml ，再將鍍膜玻片放入二氧化碳孵箱， 37 ° C 培養 6~24 小時。培養后的玻片用 pH7.4 的 PBS 漂洗 3 次，干燥后固定。

⑵ 固定：將玻片放入盛有冷丙酮的洗缸中， 4 ° C 固定 20 分鐘，漂洗，自然干燥。

⑶ 抗原片的保存：固定好的抗原片最好立即進行熒光抗體染色，若必須保存時，置于低溫下密閉保存備用。

2.熒光抗體染色法

⑴ 直接染色法 直接使熒光抗體與玻片上的抗原反應。

① 用吸管滴加 1:40 抗 RSV IgG-FITC 標記物，使其布滿整個標本區。將玻片置濕盒中， 37 ° C 孵育 30 分鐘。

② 將玻片取出，用自來水沖去多余的標記抗體液后，用 PBS 漂洗 3 次，每次 5 分鐘。最后用蒸餾水沖洗 1 次，晾干。

③ 用純度高的甘油封片，鏡檢。

⑵ 間接染色法

① 用吸管吸取 1:200 兔抗 RSV 免疫血清，滴于抗原片上，使其布滿整個標本區，約 0.025ml 。將玻片置濕盒 37 ° C 孵育 30~40 分鐘， PBS 漂洗 3 次，每次 2 分鐘。

② 滴加 1:40 抗兔 IgG-FITC 標記物于抗原片上，約 0.025ml 。將玻片置濕盒 37 ° C 孵育 30~40 分鐘， PBS 漂洗 3 次，每次 5 分鐘。標本不要太干，各染液勿混流。

③ 0.02% 伊文思藍覆蓋 5 分鐘，去染液加甘油封片，鏡檢。

結果判定

熒光顯微鏡下所觀察到的熒光圖象主要以兩個指標判斷結果，一是形態學特征，一是熒光的亮度，必須將兩者結合起來綜合判斷。

特異性熒光呈黃綠色，其強度用“ ++++ ”、“ +++ ”、“ ++ ”、“ + ”、“—”表示。

思考題

1. 何謂免疫標記技術？常用的免疫標記法有那些？

2. 熒光抗體染色的原理是什么？有那些常見方法？

酶聯免疫吸附實驗（間接法）

酶聯免疫吸附實驗 （enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA） 是一種用酶標記抗體或抗原，對相應的抗原或抗體進行測定的免疫標記技術。他利用了抗原抗體反應的高度特異性和酶促反應的高度敏感性，可敏感地檢測體液中微量的特異性抗原或抗體，具有敏感性高、特異性強、簡單、結果便于觀察、可用于大規�？焖贆z測等特點。常用方法有直接法、間接法、夾心法和競爭法等。

常用標記酶有：辣根過氧化物酶 （HRP） ，堿性磷酸酶 （AP） ，葡萄糖氧化酶 （GOD） 等。

實驗原理

先將用于檢測特異性抗體的已知抗原結合到固相載體上，再先后加入待測抗體和酶標二抗進行反應，其間通過洗液的洗滌去除未能固化到固相載體上的成分，這樣因為抗原抗體反應的特異性，就保正了只有當檢測標本中含可與已知抗原特異性結合的抗體時，標記的酶才能在反應孔中存在而不被洗去，當加入酶的底物后，底物被酶催化產生有色的產物，通過目測或分光光度計檢測 OD 值就可測出底物的降解量，從而推知存在于標本中的抗體量。

實驗材料

1. 40 孔酶標板

2. 1:300 乙肝表面抗原溶液

3. 1:10 待測血清

4. 健康人血清

5. HBsAg 診斷血清

6. 辣根過氧化物酶標記羊抗人 IgG 抗體（酶標二抗）

7. 抗原稀釋液（ pH9.6 碳酸鹽緩沖液）

8. 洗滌液（ pH7.4 磷酸鹽—吐溫緩沖液）

9. 血清稀釋液（含 0.1% 牛血清白蛋白的磷酸鹽—吐溫緩沖液）

10. 底物顯色劑（鄰苯二胺—— H 2 O 2 溶液）

11. 終止液（ 2M H 2 SO 4 ）

實驗方法

1.包被抗原:用抗原稀釋液將HBsAg按1:300稀釋成工作濃度,加入到40孔酶標板1-9孔,每孔0.1ml。第10孔加稀釋液作空白對照。酶標板置濕盒內,4°C孵育過夜。

2 ．洗滌：次日,甩去酶標板中液體,每孔加洗滌液至滿,室溫放置3分鐘后,甩干,再加入洗滌液,重復3遍。目的在于去除未吸附的抗原,最后甩干。

3. 加待測血清：用血清稀釋液倍比稀釋待測血清，方法如下表：

每管取 0.1ml 分別加入到酶標板相應的 1~7 孔內。第 8 孔加入 0.1ml 健康人血清，作陰性對照。第 9 孔加入 0.1ml HBsAg 診斷血清，作陽性對照。酶標板置濕盒內， 37 ° C 孵育 30 分鐘。

4. 洗滌：甩干酶標板中的液體，用洗滌液按照步驟 2 中的方法洗滌 3 遍，最后甩干。

5 ．加酶標二抗：將稀釋好的酶標記羊抗人 IgG 抗體按每孔 0.1ml 加入 1~9 孔，第 10 孔仍只加 0.1ml pH7.4 磷酸緩沖液。酶標板置濕盒內， 37 ° C 孵育 30 分鐘。

6. 洗滌：同步驟 4 。

7. 加底物顯色：將新配制的鄰苯二胺—— H 2 O 2 溶液按每孔 0.1ml 加到 1~10 孔中，置濕盒 37 ° C 孵育或室溫靜置 10~15 分鐘。

8. 加終止劑一滴終止顯色反應。

結果判定

第 10 孔為空白對照孔，無色，主要用于酶聯免疫檢測儀的調零。

第 9 孔為陽性對照，顯棕黃色。

第 8 孔為陰性對照，無色（有時可因操作不精細或非特異性吸附而呈極淺的黃色）。

實驗孔（ 1~7 孔）中結果陽性者，呈棕黃色。隨著抗體量的遞減，顏色也逐漸變淺。

效價孔的判定，以與陰性對照孔有顯著性顏色差異的、血清稀釋度最高的實驗孔為效價孔，其血清稀釋度即為所測抗體的效價。

注意事項：

1. 實驗操作中，注意用于不同試劑的吸管、滴管不能混用，以免發生誤差而出現假陰性或假陽性結果。

2. 鄰苯二胺屬有毒化學物質，要避免和皮膚接觸。

思考題

1. 酶聯免疫吸附實驗的基本原理是什么？常用方法有那些？

2. 間接法和直接法相比各有什么優缺點？

放射免疫測定法—— 125 I 標記技術

放射免疫測定 （radioimmunoassay, RIA） 是將同位分析的高靈敏度與抗原抗體反應的特異性相結合，以放射性同位素作為示蹤物的標記免疫測定方法。由于此項技術具有靈敏度高（可檢測出 ng 至 pg 級的微量物質）、特異性強（可分辨結構類似的抗原）、重復性好、樣品及試劑用量少、測定方法易規范化和自動化等優點，因此在醫學及其他生物科學研究領域和臨床實驗診斷中廣泛的應用于各種微量蛋白質、激素、小分子藥物及腫瘤標志物等的分析與定量測定。

RIA 常用的放射性同位素有 125I、 135I、 3H、14C等，其中以125I最常用。因其具有以下優點 ① 125 I 化學性質活潑，容易標記成功，可以用較簡便的方法標記抗原或抗體； ② 125I 衰變過程中不產生b射線，對標記蛋白、多肽等抗原的免疫活性無顯著影響； ③ 容易獲得高比放性的標記物，測定的靈敏度較高； ④ 釋放的g射線可以用晶體閃爍計數儀直接測量，方法簡便，易于推廣應用； ⑤ 125I的核素豐度、計數率及半衰期（125I60 天,135I 8.1 天）均優與135I 。

標記125I的氯胺T法：（標記甲型肝炎病毒抗體—抗 HAV IgG）

實驗原理

氯胺T是氯代酰胺類氧化劑，在水溶液中易分解形成次氯酸，將 125I-氧化成放射性單質碘（125I2），其可取代酉各氨酸殘基苯環上的氫原子，或與組氨酸殘基的咪唑環共價連接，使蛋白質或多肽發生碘化反應。

實驗材料

1. 抗 HAV IgG （約含蛋白 5mg/ml ）

2. Na 125 I （ 比放射性 >20mCi/ml） 1mlCi

3. 0.25M pH7.4 PBS ； 0.05M pH7.4 PBS

4. 氯胺 T 50 m l/100 m l （臨用前用 0.25M PBS 配置）

5. 偏重亞硫酸鈉 100 m g/100 m l （臨用前配置）

6. 1% KI （溶于 0.05M PBS ）

7. Sephadex G25 層析柱（ 1 × 20cm ）：稱 10g Sephadex G25 ，用 0.05M pH7.4 PBS 浸泡，漂洗后裝柱，然后用溶于同種緩沖液的 1% 牛血清白蛋白（ BSA ） 1ml 上柱封閉，以減少標記蛋白通過時的吸附損耗。

8. 小試管 （用于收集洗脫液的試管應先用 1%BSA 濕潤以封閉管壁）

9. 微量進樣器

10. 晶體閃爍計數儀

11.15% 三氯醋酸

實驗方法

1. 取 1 小試管，加入抗 HAV IgG 2.5 m g ， 0.05M PBS 50 m l ， Na 125 I 800 m Ci （具體體積根據 125 I 衰減表查算）。

2. 再加入氯胺 T 30 m g （快速加入，立即震搖），室溫反應 3 分鐘。

3. 加入偏重亞硫酸鈉 60 m g ，終止反應。

4. 加入 1% KI 200 m l （作為載體，用以稀釋放射性碘，減少吸附）。

5. 將上述反應液通過 Sephadex G25 層析柱，待液體進入柱床后，用 0.05M PBS 洗脫，按每管 10 滴 / 分收集，共 45~50 管。

6. 用晶體閃爍計數儀測量各管的放射值，將放射性最強的標記蛋白 3~4 管合并，加 15% 三氯醋酸沉淀蛋白，離心。測定上清和沉淀的 cpm ，求出蛋白沉淀的 cpm 占總 cpm （上清 + 沉淀的 cpm ）的百分率。

7. 計算 125 I 標記蛋白的比放射性：單位重量標記蛋白上的放射性強度稱為重量比放射性。計算公式如下：
125 I 蛋白 （ m Ci/mg）= 所用 125 I 總放射性 （ m Ci）× 125 I 標記率 / 所用蛋白總量 （ m g）

注意事項：由于實驗中使用了放射性同位素，因此實驗過程中所有含 125 I 的液體及試劑均不能隨意棄置，需集中處理。另外注意不要讓其濺入口、眼。

思考題：

1. 何為放射免疫測定法？其特點是什么？

2. 用 125 I 做為標記物有何優點？

125 I 衰減表