標題高效液相色譜法（HPLC）測定飼料中麥角固醇

摘要[目的]建立一種測定飼料中麥角固醇的高效液相色譜法。[方法]首先確定波長,流動相和流速等色譜條件,然后研究KOH濃度、乙醇與KOH溶液比例、皂化溫度和時間對麥角固醇得率的影響,確定最佳皂化條件。[結果]高效液相色譜條件為色譜柱HC-C18（4.6mm×150.0mm,5μm）,流動相為純甲醇,流速1.5ml/min,檢測波長281nm,柱溫30℃,進樣量10μ;l最佳皂化提取條件為KOH質量分數35%,乙醇與KOH溶液加入比例20∶10（V∶V）,皂化溫度85℃,皂化時間2h;優化后標準曲線方程為Y=12.541X-7.603,R2=0·99969,線性范圍為0.5~50.0mg/m;l添加水平為2.0,4.8和7.5mg/kg時,加標回收率為101%~105%,RSD為1.6%~3.8%（n=5）,最低檢測限為0.625mg/kg。[結論]該檢測方法快速、靈敏、準確、可靠,適合飼料中麥角固醇的測定。
　　
　　關鍵詞：麥角固醇;高效液相色譜;皂化
　　
　　　
　　麥角固醇的化學名稱為24β-13-甲基膽固醇-5,7烯-3β-羥基,又名麥角甾醇[1-3],其結構如圖1所示[4]。麥角固醇不溶于水,易溶于甲醇、乙醇、石油醚、庚烷等有機溶劑。麥角固醇對光、熱和O2較不穩定,大量地存在于酵母細胞中。此外,麥角固醇在谷物、配合飼料、植物組織、動物器官中都有發現[2]。麥角固醇在紫外線照射下可轉化為維生素D2,維生素D2是維生素D的主要成分之一,能夠調節Ca、P代謝,維持血鈣和血磷水平,用作飼料添加劑能顯著增加家禽、鳥類的產蛋率和孵化率[5]。
　　
　　麥角固醇的測定方法主要有紫外分光光度法[6-8]、薄層色譜法（TLC）[9]、液相色譜法（HPLC）[10-15],氣相色譜質譜法[16-18]、大氣壓化學電離與液相色譜質譜聯用法（ACPI-MS-MS）[4]等,其中,HPLC法因操作簡便,靈敏度高等特點應用較廣。目前,很多學者采用HPLC法測定了酵母、菌體中的麥角固醇,但對其他飼料原料涉及較少,且提取及測定條件差異較大。筆者通過研究酵母蛋白粉皂化過程中物料與皂化劑之比、醇堿比、皂化溫度以及皂化時間建立測定飼料中麥角固醇的高效液相色譜法,并測定了部分飼料原料中的麥角固醇。該方法的建立,將為飼料原料中麥角固醇的測定提供依據。
　　
　　1材料與方法
　　
　　1.1材料、試劑麥角固醇標準對照品（純度≥99%）,購自Sigma公司;甲醇（色譜純）,購自美國Fisher公司;無水乙醇（色譜純）,KOH（分析純）,乙醚（分析純）,購自成都市科龍化工試劑廠;所用水為Millipore儀制得的超純水。
　　
　　1.2儀器、設備AgilentHP1100高效液相色譜儀配備（VWD紫外檢測器）,購自美國安捷倫公司;BeckmanⅡ紫外分光光度計,購自美國Beckman公司;HK6200超聲波提取儀,購自上海漢克科學儀器有限公司;HH-S恒溫水浴鍋,購自江蘇國勝試驗儀器廠;回流裝置（自制）。
　　
　　1.3標準溶液的配制準確稱取麥角固醇標準品0.0500g,用無水乙醇定容至100m,l配制成濃度為0.5mg/ml的標準儲備液;將標準儲備液用無水乙醇梯度稀釋,分別配制濃度為250.0、125.0、50.0、5.0、2.5和0.5μg/ml的標準對照品。
　　
　　1.4樣品提取精確稱取100mg酵母蛋白粉倒入250m的圓底燒瓶中,加入醇堿溶液,在一定溫度下（85~90℃）的恒溫水浴鍋中回流皂化一定時間后,取下圓底燒瓶冷卻至室溫,加乙醚25ml在超聲波振蕩器中振蕩15min。將皂化液轉移到分液漏斗中,靜止2h。取上清液于燒杯中,60℃水浴蒸干乙醚,同時充N2防止麥角固醇與空氣接觸被氧化,蒸干后用無水乙醇定容至50m,l經0.22μm的有機濾膜過濾,上機測定。
　　
　　1.5色譜條件色譜柱:HC-C18柱（4.6mm×150mm,5μm）,柱溫:30℃,流動相:純甲醇,流速:1.5ml/min,檢測波長:281nm,進樣量10μ,l運行時間:10min。
　　
　　1.6添加回收及精密度試驗將麥角固醇標準溶液添加于空白飼料樣品中,添加濃度分別為2.0、4.8和7.5mg/kg。添加樣品室溫靜置30min后按照“1.4”的方法提取,測定麥角固醇含量,計算回收率和變異系數,每個添加水平設5個平行。在選定的色譜條件下,5μg/ml的標準品連續測定5次,計算保留時間和峰面積的RSD。
　　
　　2結果與分析
　　
　　2.1色譜條件的選擇
　　
　　2.1.1最大吸收波長的確定。對麥角固醇進行最大吸收波長掃描,需要使用適宜濃度的標準品。由圖2可知,250.0與500.0μg/ml的麥角固醇標準品濃度高,導致吸收峰與濃度不成相應的比例,因此,筆者采用50.0與125.0μg/ml的麥角固醇標準品進行最大波長掃描,進而確定其最大吸收波長。掃描圖中出現了3個吸收峰,其最大吸收波長為281nm,與文獻中報道的麥角固醇的最大吸收波長有一定差異[2,4,8,14],但符合麥角固醇最大理論吸收波長的范圍280~282nm。因此,采用281nm作為麥角固醇的最大吸收波長。
　　
　　2.1.2流動相的選擇。將流動相分別設定為甲醇（97∶3,V∶V）、甲醇/水（85∶15,V∶V）、甲醇（100∶0,V∶V）,其色譜條件如“1.5”,對250.0μg/ml的麥角固醇標準品和飼料樣品進行測試,根據標準品和樣品的保留時間和信號響應值確定最佳流動相。由表1可知,純甲醇做為流動相,保留時間最短,且響應信號值提高,分離效果較好。純甲醇作為流動相,250.0μg/ml的麥角固醇標準品和飼料樣品的分離圖譜如圖3和4所示。因此,選擇純甲醇作為流動相,既能有效分離樣品中的麥角固醇,又縮短分析時間,達到快速、高效分離的目的。
　　
　　2.1.3流速選擇。將流動相的流速分別設定為1.0、1.5和2·0ml/min,其他色譜條件同“1.5”,對250.0μg/ml的麥角固醇標準品和飼料樣品進行測試,根據標準品和樣品的保留時間和信號響應值確定最佳流速,結果如表2所示。由表2可知,當流動相流速為1.5ml/min時,標準品及樣品的保留時間適中,響應信號值僅略低于1.0ml/min。因此,綜合考慮快速分析及分析的靈敏度,流動相流速最終采用1.5ml/min。
　　
　　2.2皂化條件選擇
　　
　　2.2.1KOH濃度確定。精確稱取酵母蛋白粉100mg,平行5份,放入圓底燒瓶中,分別加入10%、20%、35%、50%和65%的KOH溶液10m,l加入乙醇20m,l皂化時間2h,然后按照“1.4”步驟提取,并按照“1.5”上機條件上機測試,確定最佳的KOH溶液濃度,結果如表3所示。由表3可知,當KOH的濃度升高至35%時,麥角固醇的含量最高,KOH濃度再升高,麥角固醇的濃度開始下降。其原因可能是KOH濃度太高會使麥角固醇與蛋白分子結合,以至于無法從樣品中徹底提取麥角固醇,致使麥角固醇含量降低。因此,確定KOH的濃度為35%。
　　
　　2.2.2乙醇與KOH比例的確定。精確稱取酵母蛋白粉100mg,平行5份,放入圓底燒瓶中,加入質量分數35%的KOH溶液10m,l分別加入無水乙醇10、20、30、40和50ml于85~90℃皂化,皂化2h,然后按照“1.4”步驟提取,并按照“1.5”上機條件上機測試,最終確定最佳的醇堿比,結果如表4所示。皂化劑堿常用KOH、醇用乙醇或甲醇,但有學者研究表明應用乙醇的效果優于甲醇,因此,試驗選擇乙醇[19]。由表4可知,隨著乙醇加入量的增加,麥角固醇的含量逐漸增高,當乙醇加入量為20ml時達最大,然后趨于平衡,因此,最佳乙醇加入量為20m,l即醇堿比為2∶1。
　　
　　2.2.3皂化時間確定。精確稱取酵母蛋白粉100mg,平行5份,放入圓底燒瓶中,加入質量分數35%的KOH溶液10m,l無水乙醇20ml于85~90℃皂化,皂化時間分別設定為1.0、1.5、2.0、3.0和4.0h,然后按照“1.4”步驟提取,并按照“1.5”上機條件上機測試,最終確定最佳的皂化提取時間。由表5可知,隨著皂化時間的增加,麥角固醇的含量也逐漸增加,當皂化時間為2h時達最大值,皂化時間再增加,麥角固醇的含量反而減少。原因可能是麥角固醇本身不穩定,皂化時間過長容易導致分解。因此,試驗最終確定皂化回流時間為2h。
　　
　　2.2.4皂化溫度的確定。精確稱取酵母蛋白粉100mg,平行4份,放入圓底燒瓶中,加入質量分數為35%的KOH溶液10m,l無水乙醇20m,l皂化時間2h,皂化溫度分別設定為60、70、85和95℃,然后按照“1.4”步驟提取,并按照“1.5”上機條件上機測試,最終確定最佳的皂化提取溫度,結果如表6所示。由表6可知,隨著皂化溫度的提高,麥角固醇的含量逐漸增加,當皂化溫度為85℃時,含量達最大。當皂化溫度再升高時含量降低,原因可能是皂化溫度高導致麥角固醇分解。因此,皂化溫度最終確定為85℃,這一結果與其他大多數學者的研究結果一致[19]。
　　
　　2.2.5物料與皂化劑比例的確定。精確稱取酵母蛋白粉100mg,平行4份,放入圓底燒瓶中,分別取質量分數35%的KOH溶液5、10、15和20m,l相對應無水乙醇的加入量分別為10、20、30和40m,l于85℃皂化2h,然后按照“1.4”步驟提取,并按照“1.5”上機條件上機測試,確定最佳的固液比。由表7可知,隨著皂化劑量的增加,麥角固醇的含量逐漸增加,當KOH與乙醇體積分別為10和20m,l15和30m,l以及20和40ml時,麥角固醇含量趨于平衡。從節約成本角度考慮,皂化劑量最終確定為KOH與乙醇分別為10和20ml。
　　
　　2.3線性關系和檢出限在“1.5”色譜條件下進樣10μ,l測定0.5、2.5、5.0和50.0μg/ml4個水平的標準工作液,以麥角固醇的濃度（X）為橫坐標,峰面積（Y）為縱坐標作圖,得回歸方程為Y=12.542X-7.603,相關系數R2=0.99969。由圖5可知,麥角固醇為0.5~50μg/ml時線性關系良好。根據S/N=3確定該方法的最低檢測限為0.625mg/kg。
　　
　　2.4精密度和回收率在選定的色譜條件下進行添加回收試驗,3個添加水平分別為2.0、4.8和7.5mg/kg,按照確定的皂化提取條件提取,并按照“1.5”色譜條件上機測定麥角固醇含量,計算回收率,結果見表8。由表8可知,該方法的回收率和標準偏差符合國內外有關標準和法規的要求。在選定的色譜條件下,濃度5μg/ml的標準品連續測定5次,保留時間和峰面積的RSD分別為0.15%和2.99%（n=5）。因此,該方法具有很高的靈敏度與精密度,重復性好,回收率穩定,可以為飼料的麥角固醇定量測定提供參考方法。
　　
　　3·結論
　　
　　試驗在確定了檢測波長、流動相組成和流速的基礎上,對皂化提取麥角固醇時KOH濃度、醇堿比、皂化時間、皂化溫度以及物料與皂化劑的比例進行研究,建立了一種飼料中麥角固醇的HPLC檢測方法。該方法具有靈敏度高、重復性好、準確度高、簡便、快速的特點,適合飼料中麥角固醇的測定。