標題SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理

　　 聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的一種常用電泳技術。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合過程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有兩種：化學聚合法和光聚合法�；瘜W聚合以過硫酸銨（AP）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在聚合過程中，TEMED催化過硫酸銨產生自由基，后者引發丙烯酰胺單體聚合，同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產生甲叉鍵交聯，從而形成三維網狀結構。
　　PAGE根據其有無濃縮效應，分為連續系統和不連續系統兩大類，連續系統電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應。不連續系統中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應，分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。不連續體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9 Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續性，這是樣品濃縮的主要因素。
　　蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小 和形狀等因素。如果加入一種試劑使電荷因素消除，那電泳遷移率就取決于分子的大小，就可以用電泳技術測定蛋白質的分子量。1967年，Shapiro等發現陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS）具有這種作用。當向蛋白質溶液中加入足夠量SDS和巰基乙醇，SDS可使蛋白質分子中的二硫鍵還原。由于十二烷基硫酸根帶負電，使各種蛋白 質—SDS復合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質分子原的電荷量， 因而掩蓋了不同種蛋白質間原有的電荷差別，SDS與蛋白質結合后，還可引起構象改 變，蛋白質—SDS復合物形成近似“雪茄煙”形的長橢圓棒，不同蛋白質的SDS復合物的短軸長度都一樣，約為18A，這樣的蛋白質—SDS復合物，在凝膠中的遷移率，不 再受蛋白質原的電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小由于蛋白質－SDS復合物在單位長度上帶有相等的電荷，所以它們以相等的遷移速度從濃縮膠進入分離膠，進入分離膠后，由于聚丙烯酰胺的分子篩作用，小分子的蛋白質可以容易的通過凝膠孔徑，阻力小，遷移速度快；大分子蛋白質則受到較大的阻力而被滯后，這樣蛋白質在電泳過程中就會根據其各自分子量的大小而被分離。因而SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可以用于測定蛋白質的分子量。當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數呈線性關系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數，若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量對數作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。
　　SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳經常應用于提純過程中純度的檢測，純化的蛋白質通常在SDS電泳上應只有一條帶，但如果蛋白質是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會形成分別對應于各個亞基的幾條帶。SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高的靈敏度，一般只需要不到微克量級的蛋白質，而且通過電泳還可以同時得到關于分子量的情況，這些信息對于了解未知蛋白及設計提純過程都是非常重要的。