標題高效液相色譜法測定解毒利尿顆粒中甘草酸含量

　【摘要】目的建立解毒利尿顆粒中甘草酸含量的高效液相測定方法。方法采用DiamonsilTMC18柱（250mm×4.6mm，5μm），以甲醇-[0.02mol·L-1醋酸銨-冰醋酸（33∶1）]（64∶36）為流動相，流速為1ml·min-1;柱溫30℃;檢測波長250nm。結果甘草酸在0.15～0.75μg范圍內呈良好的線性關系（r=0.9998），該方法平均回收率為98.99%，RSD為1.74%（n=6）。結論該方法簡便、穩定易行、準確、重現性較好，結果可靠，可為解毒利尿顆粒的質量評價提供有效依據。
　　
　　【關鍵詞】高效液相色譜法;解毒利尿顆粒;甘草酸
　　
　　Abstract：ObjectiveToestablishamethodfordeterminationofglycyrrhizicacidinJieduLiniaogranulesbyHPLC.MethodsDiamonsilTMC18column（5μm,250mm×4.6mm）wasusedwithmethol-（0.02mol·L-1ammoniumacetate-glacialaceticacid（33∶1））（64∶36）asmobilephase.Theflowratewas1.0ml·min-1，thecolumntemperaturewas30℃andthedetectionwavelengthwas250nm.ResultsThecalibrationcurvewerelinearwithintherangeof0.15～0.75μg（r=0.9998）.Theaveragerecoveryratewas98.99%（RSD=1.74%）.ConclusionThemethodisconvenient,stableandaccurate,soitcanbeusedfordeterminationofglycyrrhizicacidinJieduLiniaogranules.
　　
　　Keywords：HPLC;JieduLiniaoGranules;Glycyrrhizicacid
　　
　　解毒利尿顆粒由生甘草、白茅根、赤芍、紫蘇葉、生姜、豬苓等6味藥材組成，具有清熱解毒、利尿等功效，臨床上主要用于不明原因的中毒，因本品具有減輕中毒癥狀的作用，可為臨床診斷確定中毒原因提供時間。甘草為本復方制劑中的君藥，甘草酸是該藥的主要有效成分，具有抗炎、解毒、保肝和增強免疫等作用[1]，因此本實驗以甘草酸為指標進行含量測定，對本品進行質量控制。
　　
　　目前，甘草酸的含量測定方法有高效液相色譜法[2]、薄層掃描法[3]和高效毛細管電泳法[4]和光纖近紅外光譜法[5]等，因高效液相色譜法具有方法簡便、穩定、重現性好等優點，故本研究采用此法測定解毒利尿顆粒中甘草酸的含量，旨在達到對本品進行質量控制的目的。
　　
　　1儀器與試藥
　　
　　Waters1525高效液相色譜儀（配Waters2487紫外可見檢測器），MeLLennium32色譜工作站;KQ-250DB數控型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）;METTERToledoAG1351/10萬電子分析天平（瑞士METTER公司）。
　　
　　甘草酸銨（中國藥品生物制品檢定所，批號：110731-200511）。解毒利尿顆粒樣品（自制，批號：20060811，20060813，20060816）。甲醇為色譜純，水為純凈水，其他試劑均為分析純。
　　
　　2方法與結果
　　
　　2.1色譜條件色譜柱為DiamonsilTMC18（250mm×4.6mm，5μm）;流動相為甲醇-[0.02mol·L-1醋酸銨-冰醋酸（33∶1）]（64∶36）;檢測波長250nm;流速1.0ml·min-1;柱溫30℃。進樣量10μl。根據試驗結果，考慮到儀器、色譜柱、流動相的配制和溫度等系統因素的影響，規定理論板數按甘草酸峰計算，應不低于2000。
　　
　　2.2對照品溶液的制備精密稱取在五氧化二磷干燥器中干燥至恒重的甘草酸銨對照品1.25mg，置25ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每毫升含甘草酸銨50μg，相當于甘草酸48.975μg）。
　　
　　2.3供試品溶液的制備取本品（批號20060811）5袋，粉碎，稱取0.5g，精密稱定，置100ml的量瓶中，加40%甲醇稀釋至刻度，超聲提取40min，靜置，取上清液，濾過，取續濾液，即得。
　　
　　2.4陰性供試品溶液的制備按解毒利尿顆粒的處方，取除甘草提取物外的其他輔料依照本品制備工藝制備陰性樣品制劑。取陰性樣品制劑0.5g，精密稱取，按供試品溶液的制備方法制得陰性供試品溶液。
　　
　　2.5系統適應性試驗按供試品測定方法進行測定。結果表明，甘草酸對照品與解毒利尿顆粒中甘草酸的保留時間一致，陰性供試品溶液在甘草酸色譜峰位置處無相應的峰出現，同時與其他組分分離完全，分離度為2.04，理論板數按甘草酸峰計算應不低于2000。結果見圖1。
　　
　　2.6線性關系考察分別精密自動吸取此溶液3，5，8，10，13，15μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積。以進樣量X（μg）對峰面積的積分值Y進行線性回歸，計算回歸方程：Y=784579X-19762（r=0.9998），試驗結果表明甘草酸銨進樣量在0.15～0.75μg范圍內線性關系良好。
　　
　　A�哺什菟徜@對照品B�补┰嚻稢�碴幮詫φ�1.甘草酸
　　
　　2.7精密度實驗精密注入對照品溶液10μl，依法連續進樣6次，測得甘草酸峰面積的RSD=1.82%，實驗結果表明儀器精密度良好。
　　
　　2.8穩定性實驗取同一供試品溶液（批號：20060811），按0，2，4，6，8，12h時間間隔進樣，分別測定峰面積，測定甘草酸的含量結果RSD為2.92%，表明供試品溶液在12h內穩定，樣品含量無明顯變化，在此時間內測定供試品化學性質穩定。
　　
　　2.9重復性實驗取6份樣品（批號：20060811），同前法測定樣品中甘草酸的含量，RSD為2.45%，表明重現性良好。
　　
　　2.10加樣回收實驗取已知準確含量的樣品（批號：20060811，含量為125mg/袋）6份，每份0.25g，精密稱定，置100ml量瓶中。精密加入甘草酸銨對照品（2.483mg），按樣品測定方法進行測定，結果平均回收率為98.99%，RSD為1.74%，加樣回收率均符合要求。結果見表1表1加樣回收率實驗結果
　　
　　2.11樣品含量測定按上述方法，測定3批解毒利尿顆粒中甘草酸的含量。結果見表2表2樣品每袋含量測定結果
　　
　　3討論
　　
　　3.1提取方法的確定文獻報道，甘草酸的提取方法有溶劑提取法[6]、微波法[7]及超臨界CO2流體萃取法[8]等。溶劑提取法提取時間長，雜質溶出率較高，工作量大;微波法雖提取時間短，提取率高，但是雜質溶出率高;超臨界CO2流體萃取法快速、高效、選擇性專一且無污染，但存在操作壓強大，夾帶劑濃度高，萃取時間較長，儀器設備昂貴等不足。超聲提取法具有方便、快捷、提取效率高等優點，因此本試驗采用此法對甘草酸進行提取。
　　
　　3.2提取時間的確定取本品超聲處理不同時間（20，40，60，80，100min），分別測定其峰面積，結果發現超聲提取40min后，隨提取時間延長峰面積不再增加。因此本試驗中提取時間定為40min。
　　
　　3.3測定波長的選擇解毒利尿顆粒樣品及甘草酸銨對照品的光譜圖表明，甘草酸銨在250nm波長處有最大吸收，故將250nm作為樣品含量測定的檢測波長。
　　
　　3.4流動相的選擇根據文獻報道[9，10]，實驗中曾采用乙腈-水-冰醋酸為流動相，改變不同比例，均未能達到較適宜的保留時間和分離效果;選擇甲醇-醋酸銨-冰醋酸為流動相，調整比例后可以使保留時間適宜，使分離度和理論板數均符合要求。
文章鏈接：中國化工儀器網 http://www.chem17.com/news/detail/25207.html