標題小葉丁香不同部位橄欖苦苷含量的高效液相色譜法測定

目的建立新藥材小葉丁香橄欖苦苷的含量測定方法，研究小葉丁香藥材花、莖、葉中橄欖苦苷的含量。方法采用KromasilC18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，柱溫25℃；流動相為乙腈-水（25∶75），流速1.0ml·min-1；檢測波長285nm。結果橄欖苦苷的線性范圍是0.005～0.075mg/ml，r=0.9998；平均回收率為100.41%，RSD為1.46%，穩定性實驗RSD為0.56%（n=6）�；�、莖、葉不同部位藥材中橄欖苦苷的含量分別為：1.37%，0.87%，1.03%。結論該方法快速簡便，準確性重復性好，不同部位橄欖苦苷含量差異較大，為橄欖苦苷的提取和利用提供可靠的數據。
　　
　　【關鍵詞】小葉丁香；橄欖苦苷；高效液相色譜
　　
　　小葉丁香SyringapubesceusTurcz是木樨科（Oleaceae）丁香屬（Syringa）植物，產于河南、河北、陜西等地［1］。經近幾年的研究發現，小葉丁香的醇提取物具有抗肝纖維化的作用，其有效成分為以橄欖苦苷為代表的裂環環烯醚萜苷類化合物［2～6］。橄欖苦苷是一種重要的裂環環烯醚萜苷類化合物，廣泛存在于木犀科的木犀欖屬、丁香屬、女貞屬、木犀屬和茉莉屬植物中，到目前為止已提取分離出橄欖苦苷的木犀科植物至少在25種以上。研究表明橄欖苦苷具有抗真菌、抗炎、抗病毒、預防冠心病、動脈粥樣硬化、舒緩血管平滑肌、抗氧化、抗癌和降血糖等多種藥理作用。目前橄欖苦苷的測定方法主要有紫外色譜法和高效液相色譜法，其中以高效液相色譜法分析更加準確、快速、簡便。運用高效液相色譜法比較測定藥材小葉丁香中各個部位橄欖苦苷的含量的研究尚未有文獻報道。本實驗采用高效液相色譜法建立一種小葉丁香中橄欖苦苷定量測定方法，并比較不同部位橄欖苦苷的含量。
　　
　　1儀器與材料
　　
　　1.1儀器高效液相色譜儀，Waters2487紫外檢測器，EmpowerProject色譜工作站（Waters公司，美國）；BP210S電子分析天平（賽多利斯有限公司，德國）；LXJ-II離心沉淀機（上海醫用分析儀器廠，上海）；ZFQ85A旋轉蒸發器（上海醫械專機廠，上海）。
　　
　　1.2材料與試劑小葉丁香藥材采自河南省洛陽市嵩縣，經河南農業大學朱長山教授鑒定，樣品保存在河南科技大學天然產物研究室。對照品橄欖苦苷由本研究室自制，經核磁共振和高效液相色譜測定，純度大于98%。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，用時均用0.45μm的微孔膜過濾，其他試劑均為分析純。
　　
　　2方法與結果
　　
　　2.1吸收波長的選擇精密稱取橄欖苦苷10.0mg，用乙腈定容于50ml容量瓶中，稀釋10倍后用可見紫外分光光度計進行全波長掃描，用乙腈作空白，在波長200～400nm間掃描，可以看出橄欖苦苷在285nm處有明顯的吸收峰。
　　
　　2.2色譜條件Waters600高效液相色譜儀；色譜柱為KromasilC18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為乙腈-水（25∶75）；體積流量為1.0ml/min；檢測波長285nm；柱溫25℃；靈敏度0.5AUFS；進樣量20μl。按照外標法測定，色譜圖見圖2。
　　
　　2.3對照品溶液的制備精密稱取橄欖苦苷15.0mg，以乙腈為溶劑定容于100ml容量瓶中，加乙腈使其溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得橄欖苦苷對照品的母液，濃度為0.150mg·ml-1。精密吸取母液2ml于10ml容量瓶中，加乙腈至刻度，搖勻，即為對照品溶液。
　　
　　2.4溶液樣品的制備準確稱取陰干粉碎后的小葉丁香花、莖和葉粉末各10g，加入90%乙醇300ml，加熱回流提取3h，冷卻后過濾，共提取3次，合并濾液，減壓濃縮至干，殘渣用乙腈溶解并轉移定容至500ml容量瓶中，搖勻。準確吸取2ml，置于10ml容量瓶中，加乙腈至刻度，搖勻，超聲，用微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。
　　
　　2.5標準曲線的繪制精密吸取0.150mg·ml-1的橄欖苦苷標準液1，2，3，4，5ml置10ml容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻。按照上面的色譜條件分別進樣20μl進行分析，測定峰面積。以對照品的峰面積（Y）為縱坐標，進樣濃度為橫坐標（X）作圖，得線性回歸方程Y=47058X-60175，r=0.9998，表明橄欖苦苷的線性范圍是0.005～0.075mg/ml。
　　
　　2.6精密度實驗按上述色譜條件，用濃度為0.03mg/ml的對照品標準液進樣5次，每次20μl，分別測得記錄峰面積，結果測得峰面積的RSD為0.96%。
　　
　　2.7穩定性實驗取同一供試品溶液20μl于0，2，4，6，8，24h進樣，記錄峰面積，供試品溶液在24h內穩定性良好，橄欖苦苷峰面積RSD為0.56%，結果表明，樣品溶液在12h內穩定。
　　
　　2.8重復性實驗取小葉丁香花、莖和葉粉末各6份，按照“2.4”項制備樣品的方法制備樣品溶液，再按照上述色譜條件進行分析，結果表明重復性良好，花中橄欖苦苷的平均含量為1.05%，RSD為1.0；莖中橄欖苦苷的平均含量為0.84%，RSD為1.3%；葉中橄欖苦苷的平均含量為1.40%，RSD為0.8。
　　
　　2.9回收率實驗取5.0g小葉丁香花、莖和葉粉末各6份，按照上述制備母樣品溶液的方法制備樣品溶液各6份，分別準確加入0.02，0.04，0.06mg·ml-1橄欖苦苷對照品各10ml，進行3組平行實驗，每組2份，按照上述色譜條件進行分析，結果表明回收率良好，平均回收率為100.41%，RSD為1.46%。
　　
　　2.10樣品的測定取小葉丁香不同部位的粉末按“2.4”項中方法制備樣品溶液6份，按照上述色譜條件進行分析，測定橄欖苦苷的含量。結果表明花中橄欖苦苷的平均含量為1.37%，RSD為1.2%；莖中橄欖苦苷的平均含量為0.87%，RSD為1.1%；葉中橄欖苦苷的平均含量為1.03%，RSD為1.5%。
　　
　　3討論
　　
　　本文采用HPLC法測定小葉丁香中橄欖苦苷的含量，方法準確、靈敏、快速，為小葉丁香中橄欖苦苷的研究開發提供科學合理的檢測方法和檢測指標。
　　
　　實驗結果表明，采自伏牛山區嵩縣車村鎮的小葉丁香，不同部位橄欖苦苷的含量具有明顯的差別，其中花中橄欖苦苷的含量最高，莖中含量相對較低。研究為小葉丁香中橄欖苦苷的提取純化和該藥材的進一步研究開發利用提供了依據。