標題酶解小麥蛋白產物還原糖美拉德反應的光譜研究

【摘要】采用紫外�部梢娢�收光譜和熒光光譜研究了酶解小麥蛋白產物與還原糖不同加熱條件下的美拉德反應及其產物。美拉德反應在紫外區240和294nm產生兩個特征峰，熒光的最大激發和發射波長為347和450nm;隨反應進行，紫外光吸收和熒光強度迅速增加，表明美拉德反應進入高級階段，產生的糠醛類、呋喃酮類、吡喃酮類、噻吩類及噻唑類等小分子物質表現較大的積累速率。溫度升高，強度增加速率增大。在較高溫度時，紫外光吸收出現最大平穩值;熒光強度則到達最大值后降低，表明小分子物質間或與肽聚合生成大分子黑素類物質，小分子物質的積累表現消除速率，反應進入終級階段。
　　
　　【關鍵詞】水解植物蛋白，美拉德反應，Strecker降解，紫外�部梢娢�收光譜，熒光光譜
　　
　　1引言
　　
　　水解植物蛋白是指用酶、酸或堿水解大豆、小麥、玉米等植物蛋白得到的混合產物[1]。水解植物蛋白由于其價格低廉、質構功能性優良和較高的營養價值而被廣泛應用于食品生產中。主要將其作為原料制備美拉德反應型香精料[1～3]或作為添加成分提升食品的感官和營養品質[4,5]。水解植物蛋白的這類應用是通過美拉德反應實現的。
　　
　　利用水解植物蛋白制備香味的美拉德反應，主要是反應高級階段糖降解和Strecker降解產生糠醛類、呋喃酮類、吡喃酮類、吡啶類、吡嗪類、噻吩類及噻唑類等揮發或半揮發性小分子氣味物質[6];反應過程復雜，難于應用反應動力學對其進行設計和監控;反應產物種類繁多，已有的檢測方法繁瑣耗時[7]。因此，研究一種簡單、快速、有效的美拉德反應程度監控方法，對于優化反應條件和控制生產是十分必要的。本研究以酶解小麥蛋白產物（wheatproteinenzymatichydrolysates，eWPH）為原料，設計了產生肉香味的美拉德反應，對不同溫度�矔r間組合下的美拉德反應進行了光譜學研究，以紫外�部梢娢�光譜和熒光分析為指標，對反應程度和產物進行了表征和剖析。
　　
　　2實驗部分
　　
　　2.1儀器、材料與試劑
　　
　　UV��2102PC紫外�部梢姺止夤舛扔嫞ㄉ虾Ｓ饶峥鹿�司）;F��2500熒光分光光度計（日本Hitachi公司）;Biofuge臺式冷凍高速離心機（德國Heraeus公司）;螺口密封玻璃管（16mm×160mm，德國Schott公司）;DKU��3恒溫油槽（上海精宏公司）。小麥蛋白,蛋白質含量>70%（青島中際華興國際貿易有限公司提供）。L�舶腚装彼�、木糖和葡萄糖（生化試劑，含量>98.5%）;堿性蛋白酶、Flavourzyme風味酶和α�驳矸勖笧樯�化試劑。其它試劑均為分析純。
　　
　　2.2實驗方法
　　
　　2.2.1酶解小麥蛋白產物的制備取40g小麥蛋白配制10%（w/V）的懸浮液，調節pH至7.0，預熱至50℃，加入堿性蛋白酶、Flavourzyme風味酶和α�驳矸勖�，酶與蛋白比例為0.5%，恒溫攪拌，水解8h。水解結束后，升溫至100℃，保持5min，滅酶活。冷卻至室溫，以4000r/min離心15min，上清液即為酶解產物。作3個水解平行樣品，合并上清液并定容至1200mL。
　　
　　2.2.2酶解小麥蛋白產物分析采用凱氏定氮法測定蛋白含量;3，5�捕�硝基水楊酸比色法[8]測定還原糖含量;甲醛滴定法[9]測定水解度;高效液相色譜法[1]測定產物分子量分布。
　　
　　2.2.3酶解小麥蛋白產物制備肉香味的美拉德反應設計文獻[2]報道eWPH與還原糖和含硫化合物制備肉香味的美拉德反應參數主要是pH、溫度、時間、還原糖和含硫物質種類和用量。本研究在文獻[7,10]的基礎上確定將5g木糖/葡萄糖和1.35gL�舶腚装彼崛芙庥�40mL小麥蛋白水解液中，用0.1mol/LHCl或0.5mol/LNaOH調節混合液pH5.5。樣品在預定溫度下加熱一定時間后，取出，冰浴冷卻。-40℃凍存12h，室溫自然融解，12000r/min離心60min，除去反應產生的褐色不溶物質，上清液用于光譜分析�？瞻走M行同樣處理。
　　
　　2.2.4美拉德反應紫外�部梢娢�收光譜的測定取所有樣品上清液稀釋100倍。以空白樣品為基線，用1cm石英比色皿于198～450nm波長范圍內測定不同條件下美拉德反應的紫外�部梢娢�收光譜。記錄特征吸收峰的波長和強度。
　　
　　2.2.5美拉德反應熒光分析取紫外�部梢娢�收光譜的測試樣液，參照文獻[11]的方法，掃描確定eWPH與還原糖反應體系的最大激發（λex）和發射波長（λem），測定樣品在此波長下的熒光強度。
　　
　　3結果與討論
　　
　　3.1酶解小麥蛋白產物分析
　　
　　采用2.2.2的方法，分析得到酶解小麥蛋白產物的蛋白質含量為75.5g/L;還原糖含量為0.91%;水解度為21.8%。分子量分布情況為：<1000Da（34.94%）;1000～5000Da（46.64%）;>5000Da（18.42%）。
　　
　　復合酶水解法水解度高，產物澄清透明、低苦味，廣泛用于蛋白質的水解中。本實驗發現，堿性蛋白酶和風味酶復合對小麥蛋白的水解效果較好。小麥蛋白原料中除了蛋白質外，主要是淀粉，所以水解時添加了淀粉酶。酶解產物溶液中還原糖含量為0.91%，與蛋白質的比例約為1∶8。
　　
　　3.2紫外�部梢娢�收光譜的分析和反應產物剖析
　　
　　美拉德反應通�？煞譃閹讉�階段[11]。初始階段起始于羰基和氨基的縮合，生成Amadori/Heyns化合物;高級階段主要是Amadori/Heyns化合物降解，釋放氨基化合物，糖類物質通過烯醇化生成高反應活性的鄰酮糖類（Oosones）[12]、糠醛類等物質;高反應活性的鄰酮糖物質極易裂解生成酮類物質，酮類物質可進行醇醛縮合，或重新與氨基化合物反應，生成復雜的具有特征性風味的小分子物質;終級階段主要是高級階段產生的小分子物質自身或相互間聚合生成大分子褐色物質，使體系表現出顯著的顏色特征。對于產生香味的美拉德反應，高級階段的糖裂解和Strecker降解是至關重要的反應步驟。該過程產生的小分子物質是賦予特征風味的成分。vanBoekel等[6]構建了產生肉香味美拉德反應框架。實際上，美拉德反應是連續的瀑布式反應過程，生成的風味小分子物質可作為反應物進入終級階段，使小分子物質的產生速率和積累量隨熱處理程度而變化。
　　
　　研究確定小分子物質具有最大產生速率和產量的反應條件是有意義的。但是，美拉德小分子產物種類極其復雜，定量分析困難。文獻[12]報道，美拉德反應的小分子產物具有強紫外光吸收和熒光，所以應用分光光度法表征小分子物質的產生速率和產量是一種簡便、快速且低成本的新選擇。美拉德反應主要影響因素是介質pH、加熱溫度、時間、還原糖和含硫物質種類和用量等。溫度�矔r間組合是最重要的參數，也是生產過程中的易調節因素。本實驗采用分光光度法分析不同溫度�矔r間組合下eHWP與還原糖的美拉德反應程度和小分子產物情況。樣品在預定溫度（120，140和160℃）下加熱一定時間（10，20，30和60min）。所有添加木糖的樣品稱為R�蚕盗�，添加葡萄糖為G�蚕盗�，添加無糖和L�舶腚装彼岬膶φ諛悠贩Q為C�蚕盗��？瞻诪�3個系列的無加熱樣品。eHWP�策�原糖熱處理后的紫外�部梢娢�收光譜如圖1所示，混合物加熱后即在紫外區240和294nm產生兩個特征吸收峰。
　　
　　圖2為3個溫度下兩個吸收峰強度隨加熱時間的變化曲線。與G�埠蚏�蚕盗邢啾�，C�蚕盗械墓馕�收強度很小，表明這兩個吸收峰主要是美拉德反應產生的。294nm光吸收是由糖裂解產生的酮、醛類等無色小分子物質產生的[14～16]。240nm吸收峰鮮有報道，一般認為具有共軛雙鍵的物質在此波長下有特征光吸收。本研究體系中，240nm吸收峰可能是由于半胱氨酸受熱脫硫生成氨基丙烯酸或Amadori化合物降解生成具有共軛雙鍵的鄰酮糖類[13]而產生的。美拉德反應高級階段小分子產物具有強紫外吸收的特征已經被證明和應用，但物質種類復雜，目前尚未對其進行確認。
　　
　　隨著溫度升高或加熱時間延長，兩個特征峰強度增加，表明美拉德反應產生的具有紫外吸收的呋喃酮類、吡喃酮類、吡咯類、噻吩類、吡啶類及吡嗪類等的小分子物質的積累。這些小分子物質是對肉香味有貢獻的成分[7]。但是在較高溫度時，兩個峰強度出現最大穩定值，表明已生成的無色小分子物質之間或與肽等發生聚合反應，進入到終級階段，生成褐色的大分子黑素類物質，從而使小分子的積累表現出一定的消除速率。當消除速率與生成速率平衡時，在紫外光吸收圖譜上即表現為峰強度遲滯不變，甚至有所下降。對于產生香味的美拉德反應，這種使香味小分子消除的聚合反應是不期望的。
　　
　　3.3熒光分析對小分子產物的表征
　　
　　研究表明，美拉德體系中熒光強度與紫外光吸收強度的發展表現為不同的動力學行為[14～16]，所以熒光小分子物質被認為是不同于具有紫外光吸收物質的小分子產物。
　　
　　eHWP與還原糖熱處理后的熒光分析表明，本反應體系347nm激發的450nm的熒光光譜與其它美拉德反應體系[14，15]的結果相似。但不同于蛋白質因含有色氨酸殘基而具有的熒光（λex=290nm，λem=336nm）[17]，所以體系的熒光是由美拉德反應引起的，熒光強度表征了高級階段熒光小分子物質的產生狀態。圖3為不同溫度�矔r間組合下eHWP與還原糖混合物的熒光強度。C�蚕盗�、G1和R1在60min的加熱時間內熒光強度持續增加;G2，G3，R2和R3的熒光在加熱一定時間時達到最大值，然后降低。表明美拉德反應進入終級階段，小分子物質相互間或與肽等聚合成大分子褐色黑素類物質，使小分子物質的積累速率降低;熒光強度隨時間延長而下降則是小分子物質的聚合消除速率大于生成速率，是產香美拉德反應所不期望的。
　　
　　結合圖2和圖3，紫外�部梢姽庾V和熒光分析對美拉德反應程度的表征結果是一致的。120℃加熱60min，140℃加熱20min以及160℃加熱10min期間，香味小分子物質具有較大的積累速率，是產生香味的美拉德反應較優的溫度�矔r間組合。