標題分光光度法測定夏枯草中總黃酮的含量

　【摘要】目的研究可見光及紫外光分光光度法測定夏枯草中總黃酮含量的方法。方法可見光分光光度法是以蘆丁為參照品,硝酸鋁作顯色劑，在510nm波長處測定總黃酮含量；紫外光分光光度法是以蘆丁為參照品，在357nm波長處測定總黃酮含量。結果可見光法平均回收率為97.76%，紫外光法為99.10%，前者的RSD值是1.02%，后者的RSD值是0.88%。結論紫外分光光度法具有簡便、快速、準確、經濟的優點，是一種較理想的測定夏枯草中總黃酮含量的方法。
　　
　　【關鍵詞】夏枯草；總黃酮；分光光度法
　　
　　Abstract：ObjectiveTodeterminethetotalflavonecontentinPrunellavulgarisL.byVISandUVSpectrophotometry.MethodsThecontrolsampleofVISSpectrophotometrywasrutin,therevealingagentwasAl（NO3）3andtheanalyzedwavelengthwas510nm.ThecontrolsampleofUVSpectrophotometrywasrutinandtheanalyzedwavelengthwas357nm.ResultsTheaveragerecoveriesofVISandUVSpectrophotometrywere97.76%and99.10%,theRSDwere1.02%and0.88%respectively.ConclusionUVspectrophotometryissimple,rapid,accurate,economicalandissuitableforcontentdeterminationoftotalflavonesinPrunellavulgarisL..
　　
　　Keywords：PrunellavulgarisL.;Totalflavones;Spectrophotometry
　　
　　中藥夏枯草為唇形科夏枯草屬植物夏枯草PrunellavulgarisL.的干燥果穗，全國大部分地區均有分布，易栽培，資源豐富。主要含有三萜及其苷類、苯丙素類、甾醇及其苷類、黃酮類、香豆素、有機酸、揮發油及其糖類等。全草均可入藥，其味辛、微苦，性微寒，具有清火、明目、散結、消腫之功效。常用于治療頭痛、眩暈、瘰疬、癭瘤、乳癰腫痛、甲狀腺腫大、淋巴結結核、乳腺增生癥等疾�。�1］。目前，有關植物中黃酮類物質的測定方法主要有分光光度法和高效液相色譜法等［2～4］，其測定夏枯草總黃酮含量的方法還未見報道。本文分別采用可見光和紫外光分光光度法測定夏枯草中總黃酮的含量，并對兩種方法進行了比較，擬尋找出一種準確而簡便的測定夏枯草中總黃酮含量的方法，為合理科學開發這一寶貴的中藥資源，深入研究其確切的藥理作用提供可靠的理論和實驗依據。
　　
　　1器材與方法
　　
　　1.1材料
　　
　　1.1.1試劑與原料
　　
　　無水甲醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等試劑均為分析純；蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號：0080-9705）；夏枯草藥材購于廣州市藥材公司（由廣東藥學院生藥研究室鑒定），經粉碎后過60目篩，放入60～80℃烘箱中干燥12h后，稍加冷卻，放入干燥器中備用。
　　
　　1.1.2儀器與設備
　　
　　上�；萜�6010型紫外-可見分光光度計；上海二分7230G可見光分光光度計；北京賽多利斯電子分析天平；索氏提取器；F120型粉碎機；RE52286A型旋轉蒸發器等。
　　
　　1.2方法
　　
　　1.2.1藥液的制備
　　
　　精確稱取夏枯草干粉2.5000g置于索氏提取器中，石油醚回流以除去試樣中的脂類及色素，至提取管中呈無色。將石油醚提取后的殘渣，用200ml無水甲醇，抽提至無色。提取液全部轉移到250ml容量瓶中，用無水甲醇定容作為實驗用液，待測。
　　
　　1.2.2可見光分光光度法標準曲線的繪制［5］精確稱取經120℃下干燥至恒重的蘆丁對照品10.0mg，用無水甲醇溶解，轉移至100ml容量瓶中，用無水甲醇定容，搖勻，即得蘆丁對照品溶液（每毫升溶液含蘆丁對照品0.1mg）。
　　
　　準確吸取0.1mg/ml的蘆丁對照品溶液0.00，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00ml，分別置于25ml容量瓶中，各加甲醇至10ml，分別加5%亞硝酸鈉溶液1.00ml，搖勻，放置6min后分別加10%硝酸鋁溶液1.00ml，搖勻，放置6min，再分別加1%氫氧化鈉溶液10.00ml，并用甲醇定容至刻度，搖勻，放置15min后，以無水甲醇溶液為空白液，在波長510nm處測各溶液的吸光度，得回歸方程為：A=0.02093C－0.0121〔A為吸光度，C為濃度（mg/L）〕，相關系數r=0.9996。表明蘆丁對照品溶液濃度處于2～32mg/L范圍內時，吸光度與其濃度間呈現出良好的線性關系。
　　
　　1.2.3可見光分光光度法回收率實驗精確稱取6份已知總黃酮含量的夏枯草粉末2.500g，加入一定量的蘆丁對照品，按照“1.2.1”項所述制得實驗液，按照“1.2.2”項所述顯色并測定吸光度，由回歸方程計算總黃酮含量，按下式計算回收率。
　　
　　回收率（%）=混合后實測總黃酮含量－樣品中總黃酮的含量蘆丁標準加入量×100%（1）
　　
　　1.2.4可見光分光光度法樣品的總黃酮含量測定分別準確吸取1.00ml實驗用液入25ml容量瓶中，按照“1.2.2”項所述方法顯色后，在510nm波長處測定吸光度A，由回歸方程計算出樣品中總黃酮的含量。
　　
　　1.2.5紫外光分光光度法標準曲線的繪制［6］精確稱取在120℃干燥恒重的蘆丁對照品10.0mg于100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.100mg/ml蘆丁對照品溶液。
　　
　　精確量取上述溶液0.00，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00ml，至于10ml量瓶中，加甲醇稀釋到刻度,搖勻，制成蘆丁含量為2～32mg/L的系列標準溶液。以甲醇為試劑空白，在357nm波長處測定其吸光度，結果表明蘆丁的甲醇溶液在2～32mg/L濃度范圍符合Beer定律，吸收度與其濃度呈良好的線性關系，其回歸方程為：A=0.0317C－0.0139〔A為吸光度，C為濃度（mg/L）〕，相關系數r=0.9998。
　　
　　1.2.6紫外光分光光度法回收率實驗精密稱取6份已知總黃酮含量的夏枯草粉末2.500g，加入一定量的蘆丁對照品，按照“1.2.1”項所述制得樣品液，用甲醇稀釋樣品液，在357nm處測定吸光度A，由回歸方程計算總黃酮含量，按公式（1）計算出回收率。
　　
　　1.2.7紫外光分光光度法樣品的總黃酮含量測定分別準確吸取1.00ml試驗用液入25ml容量瓶中，用甲醇稀釋定容，在357nm波長處測定吸光度A，由回歸方程計算出樣品中總黃酮的含量。
　　
　　2結果
　　
　　2.1樣品的總黃酮含量測定黃酮類化合物具有特定的紫外吸收帶，其結構中的肉桂酰環產生的Ⅰ帶在300～400nm內，而由苯甲酰環產生的Ⅱ帶在240～285nm內，不同的黃酮在這兩個吸收帶的吸收強度不同［7］。含黃酮類化合物的原料經一定的方法提取純化后，可直接于最大吸收波長處測定其吸收度，以蘆丁為對照品對照計算其含量［8］。本實驗選擇蘆丁在Ⅰ帶的最大吸收波長357nm作為紫外光分光光度法的測量波長。
　　
　　取不同產地的夏枯草樣品，分別用可見光分光光度法和紫外光分光光度法對每個樣品平行測定6次，得各個樣品的總黃酮平均含量如表1所示。表1不同產地夏枯草樣品的總黃酮含量（略）
　　
　　從表1可見，不同產地的夏枯草全草的總黃酮含量有一定差異，其中以貴州貴陽產夏枯草黃酮含量最高，而海南�？诋a夏枯草黃酮含量最低。其次，用可見光分光光度法測得的總黃酮含量總是比用紫外光分光光度法測得的總黃酮含量要高，這可能是因為夏枯草的化學成分中含多種萜類，其中相當部分萜類的分子結構中含有能與鋁離子絡合顯色的酚羥基，而可見光分光光度法是在強堿性溶液與鋁離子反應后顯色，酚羥基在該條件下能與鋁離子結合，在510nm處也容易被吸收，這樣導致用可見光分光光度法測定出的結果有所偏高［9～11］。
　　
　　2.2回收率實驗把一定量的蘆丁對照品加入已知總黃酮含量的貴州夏枯草中做回收率實驗。結果見表2。表2貴州貴陽夏枯草總黃酮回收率實驗結果（略）
　　
　　由表2可見，采用可見光分光光度法，回收率范圍為96.43%～98.96%，其RSD值為1.02%；而用紫外光分光光度法，回收率范圍為97.85%～100.06%，其RSD值為0.88%，兩者均符合定量分析的要求。
　　
　　3討論
　　
　　黃酮類化合物廣泛存在于自然界的植物當中,具有多種生物學活性,是中藥材藥物內的一類重要化學成分，具有多種藥理作用,諸如抗氧化作用、消炎作用、抗癌和抗基因誘變作用等。上述實驗表明，夏枯草中含有極為豐富的黃酮類物質，但不同產地的夏枯草全草中所含有的總黃酮成分存在較大的差異,這可能與藥材的生長環境、采收季節、提取方法以及貯藏條件等都有一定的關系。實驗結果進一步表明，采用可見光分光光度法和紫外光分光光度法這兩種常規方法測定夏枯草中總黃酮的含量時，都有較好的線性關系。但由于紫外光分光光度法能直接測定夏枯草總黃酮的含量，不需用硝酸鋁顯色，從而能夠避免夏枯草中萜類化合物酚羥基的干擾，方法簡便、快捷、準確而又經濟，是測定夏枯草總黃酮含量更為可取的方法，適合于各基層單位推廣采用。