影響免疫組化染色結果的因素有很多，除了免疫組化染色操作因素外，還包括組織切片制備各個環節的因素。因此，免疫組化技術的操作規范也要包括組織切片技術的規范。
一、免疫組織化學技術對組織切片的要求
免疫組織化學技術適用于冰凍切片和石蠟切片，部分抗體只能用于冰凍切片，大部分抗體可用于石蠟切片，適用于石蠟切片的抗體也適用于冰凍切片。冰凍切片能很好地保存
組織抗原，抗原丟失少，但形態結構差，定位不很清晰；石蠟切片組織形態結構好，定位清晰，但在組織的固定、脫水、包埋等過程中容易破壞組織抗原，使抗原的免疫活性有所
降低。因此在檢測石蠟切片組織抗原時，盡可能保存組織抗原的免疫活性十分重要。
二、組織的固定
組織離體以后應及時取材固定，組織經過固定后可保存組織原有的形態結構，防止組織抗原彌散。常用的固定液為10％ 福爾馬林液（4%甲醛液），最好選用10％中性福爾馬林液
，固定時間為4-6小時，一般不超過24小時。固定時間不足，組織結構不佳，組織抗原彌散；固定時間過長，可封閉或破壞組織抗原。
冰凍切片常用的固定液為無水丙酮或4%多聚甲醛，固定時間為10-20min。
三、載玻片的處理
組織切片貼在載玻片上進行免疫組織化學染色，由于染色過程操作步驟及沖洗次數較多，容易出現脫片現象，因此將載玻片涂膠或硅化是必要的。較常用效果較好的是硅化玻
片。
硅化玻片的制備：
1. 載玻片經酸洗，沖洗干凈后烤干。
2. 2％APES丙酮溶液浸1-2min。
3. 無水丙酮液浸1-2min。
3. 蒸餾水浸洗1-2min。
4. 烤干備用。
可用無水酒精代替無水丙酮，也可以直接配成APES水溶液使用。
�。� APES（3-AMINOPROPYLTRIETHOXY-SILANE） 氨丙基三乙氧基硅烷 SIGMA產品。
四、組織切片前處理
經福爾馬林溶液固定，石蠟包埋的組織在固定過程中，組織中的抗原蛋白與甲醛產生交聯，使得組織中抗原的決定簇被封閉，抗體難以和抗原充分結合。因此要進行組織切片
前處理，目的是打開組織抗原蛋白與甲醛的交聯，暴露組織抗原，以提高組織抗原的檢出率。組織切片前處理（也稱抗原修復）常用的方法主要有：
1. 胰蛋白酶消化法
將切片置入胰蛋白酶消化液（0.1％胰蛋白酶 0.1％氯化鈣水溶液 pH7.8）消化30分鐘，37℃。
2. 水煮法
將切片置入蒸餾水內，加熱至沸騰持續10分鐘，自然冷卻。
3.微波加熱法
常規是將切片置入0.01mol/L pH6.0的檸檬酸緩沖液內，用微波爐最大功率（約800W）加熱10分鐘，自然冷卻。
4. 高壓加熱法
用高壓鍋加熱0.01mol/L pH6.0的檸檬酸緩沖液至沸騰，放入切片，蓋緊高壓鍋蓋，繼續加熱至減壓閥噴氣，計時90秒鐘至2分鐘，自然冷卻。
5.聯合處理法
按上述方法先進行胰蛋白酶消化，然后再進行水煮法或微波加熱法或高壓加熱法。
是否進行切片前處理要按第一抗體說明書的要求，切片前處理通�？梢蕴岣呙庖呓M化染色的陽性率，但并非所有的抗體染色均需要前處理。切片前處理不當會出現： 假陽性、假陰
性或陽性定位改變
五、內源性過氧化物酶的消除
組織中的粒細胞、單核細胞及紅血球等存在內源性過氧化物酶，可與顯色劑DAB、AEC起反應而造成假陽性，因此，在顯色前要把這些內源性過氧化物酶消除，方法是用3％過氧
化氫作用15分鐘。操作可以在加一抗之前也可以在加一抗之后。
六、內源性生物素的消除
組織細胞中存在著內源性生物素，在應用與卵白素結合或生物素標記抗體的免疫組化檢測系統檢測組織細胞中的抗原時，內源性生物素容易與ABC法中的卵白素（avidin）或S
-P（LSAB）法中的鏈霉菌抗生物素蛋白（streptavidin）結合，引起假陽性。因此在加一抗 之前或在加一抗之后需要消除內源性生物素。消除內源性生物素的方法有：（1）用雞蛋
清或卵白素封閉。（2）采用不含卵白素或生物素的免疫組化檢測系統檢測如Envision/Elivision二步法和EPOS一步法等。
七、高敏感免疫組化染色方法的選用
免疫組織化學技術的特點之一是敏感性高，就是能把抗原抗體結合物特異性地放大。目前，免疫組化染色方法有一步法，二步法和三步法。一般來說，抗體與抗體的連接步驟
少，特異性高，敏感性低；反之，連接步驟多，特異性低，敏感性高。但是，不同公司生產的試劑盒，技術由于不斷地改進和提高，在特異性和敏感性方面各有特點。各實驗室可
以根據自己的實際情況對照比較，合理選用。目前應用最廣泛的是S-P（LSAB）三步法和Envision/Elivision二步法。同一種染色方法，因檢測試劑盒的不同其敏感性不同，第一抗
體的稀釋度也不同。
八、第一抗體與免疫組化檢測系統的正確配套
常用的第一抗體一般為單克�。ㄊ罂梗┖投嗫寺。ㄍ每梗┛贵w，也有羊抗的抗體。常用檢測試劑盒中的第二抗體也有分為抗鼠、抗兔或抗羊免疫球蛋白，不能錯配，否則一抗
、二抗連接不上而導致假陰性的染色結果。最好選用既含抗鼠又含抗兔和抗羊免疫球蛋白的抗體。
九、酶標抗體系統中的酶與顯色劑的合理選用
在S-P等常用免疫組化方法中，標記抗體的酶主要有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP或AKP），顯色劑有DAB、AEC、固紅和固藍等。在HRP系統用DAB和AEC作顯色劑，DAB顯
色陽性物呈棕色，AEC呈紅色；AP系統用固紅、固藍或BCIP/NBT作顯色劑，固紅顯色陽性物呈紅色，而固藍、BCIP/NBT呈藍色。DAB顯色形成的沉淀物最穩定和不易褪色，較為常用
，因其是致癌物，故要避免接觸皮膚和污染環境。
在多重免疫組化染色中，合理選用酶標抗體檢測系統和顯色劑，在同一切片上可以清晰地顯示組織細胞中多種抗原的表達。
十、實驗對照的設置
為證實抗體和檢測試劑盒效價是否可靠，染色操作是否正確，一般需要進行實驗對照，以避免試劑失效或操作失當而出現假陰性和假陽性，確保染色結果的可靠性。
1.陽性對照：選用已知染色中度陽性以上的組織切片染色，陽性切片應呈陽性 ，此外組織中的內對照也是很好的陽性對照。初學者更應設陽性對照。
2.陰性對照：選用已知染色陰性的組織切片染色，其結果應為陰性，一般來說，陰性對照和陽性對照同時進行，或其中有陽性染色結果時才有意義。
十一、免疫組織化學染色后的背景復染
免疫組織化學技術的另外一個特點是抗體在組織中的定位準確。因此，免疫組織化學染色后需要復染細胞核，以將組織細胞結構顯示出來，使免疫組織化學染色結果定位清晰
。免疫組織化學染色結果根據顯色劑的不同而不同，有棕色、藍色和紅色，復染細胞核的顏色也因染液不同而不同，一般有藍色（蘇木素）、綠色（甲基綠）和紅色（核固紅）三
種。應根據顏色對比清晰的原則進行搭配，常用的是DAB顯色呈棕色，Mayer~s蘇木素復染細胞核呈藍色。甲基綠復染細胞核，顏色鮮艷，特別適用于顯微照相，但容易腿色。
十二、免疫組化染色結果的觀察
1. 陽性結果應定位在細胞中相應的部位，在細胞膜表達的抗原陽性結果應
定位在細胞膜上，在其他部位的陽性反應均為非特異性染色。不當的組織切片前處理會導致抗原在組織細胞中定位的改變。根據所檢測抗原的不同，抗原分別定位在：（1）細胞膜
如LCA和UCHL1等。（2）細胞漿如Keratin和Lysozyme等
（3）細胞核如PCNA和ER、PR等
2. 不當的組織切片前處理有可能出現假陽性或假陰性的結果。
3. 組織的周邊、刀痕、皺折等部位往往呈陽性反應，但絕大多數都是非特異性染色。
4. 染色結果呈陰性并非都是抗原不表達，要考慮是否與組織中的抗原受到破壞有關。
5. 組織切片背景深與下列因素有關：
（1）第一抗體濃度太高或孵育時間過長，溫度過高。
（2）顯色劑DAB濃度過高或H2O2太多。
（3）正常血清封閉之后、滴加第一抗體之前用了PBS洗。
（4）抗體純度不高。
（5）抗體孵育切片后沖洗不干凈。
十三、抗體的保存和稀釋
抗體應于低溫保存，第一抗體可分成小包裝于-20℃保存，使用時存放在4℃，不宜反復存放于4℃和-20℃之間。檢測試劑盒一般存放于4℃，不宜于-20℃保存，如長時間不用
可存放于-20℃，解凍使用后則不能再存放于0℃以下，因為反復凍融使得與抗體結合的酶容易離解，導致檢測的敏感度降低。
濃縮的抗體在染色前應根據說明書要求或自行摸索出的最佳工作濃度進行稀釋。日常工作量不多時，可將抗體稀釋至1:5-20，染色前再稀釋成工作液。濃縮液抗體保存的時間
較長，反之稀釋后的抗體保存的期限較短，如使用即用型抗體，經過一定時間后應注意其效價是否有所降低，避免出現假陰性染色�？贵w稀釋液可用商品化的抗體稀釋液，也可以
用0.01mol/L PBS（ pH7.4），在PBS中加入1％BSA和10％正常血清后稀釋抗體，對減輕非特異性背景染色有所幫助。
十四、其它注意事項
1．石蠟切片脫蠟要徹底。
2．抗體孵育時間隨孵育溫度升高而減少，但一般不超過37℃；如果不是由于診斷急需，一抗置于4℃孵育過夜也是一種較佳的選擇。
3．滴加抗體應完全覆蓋組織，避免引起組織邊緣效應。
