標題ELISA雙抗體夾心法原理、特點和實驗步驟

1、原理

ELISA 的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。加入酶標記的抗原或抗體，通過反應也結合在固相載體上。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，根據呈色的深淺進行定性或定量分析。酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。

2、特點

某些分泌型蛋白，用siRNA 干擾后可以用ELISA 進行檢測。

3、ELISA 實驗流程示圖（以雙抗體夾心法為例）

4、試劑與耗材

（1） 包被緩沖液 （pH 9.6 0.05 M 碳酸鹽緩沖液）：

（2）洗滌緩沖液 （pH 7.4，0.15 M PBS）：

（3）稀釋液：

（4）終止液（2 M H₂SO₄）：

（5）底物緩沖液 （pH 5.0）：

（6）四甲基聯苯胺（TMB）使用液：

（7）2，2’-連氮基-雙-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺（ABTS）使用液：

（8）抗原、抗體和酶標記抗體：按說明書處理。

（9）標準品：用稀釋液稀釋成梯度濃度溶液。

（10）96 孔聚苯乙烯塑料板 （酶標板）。

2、實驗步驟（雙抗體夾心法）：

（1）包被：用包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1-10 μg/mL。在酶標板反應孔中加0.1 mL，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗板3 次，每次3 min。

（2）加樣：加一定濃度稀釋的待檢樣品（同時做空白對照，陰性對照孔及陽性對照）0.1 mL 于上述已包被的反應孔中，置濕盒中，37℃， 1 hr。用洗滌緩沖液洗板3 次，每次3 min。

（3）加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體 （經滴定后的稀釋度） 0.1ml。

37℃，0.5 - 1 hr，用洗滌緩沖液洗板3 次，每次3 min。

（4）加底物液顯色：于各反應孔中加入現配的TMB 底物溶液0.1 mL，37 ℃，10 - 30min。

（5）終止反應：于各反應孔中加入終止液0.05 mL。

（6）結果判定：將酶標板在酶標儀上，于450 nm （若ABTS 顯色，讀410 nm），讀數，輸出到Excel 中。

（7）以標準品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，生成標準曲線和直線回歸方程式，根據公式計算未知樣品的濃度，并記錄。