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（請以英文為準，中文僅供參考）

試劑盒特點【乙炔雌二醇檢測試劑盒】

1.AP單克隆抗體特異地與AP結合，和其它結構相類似的化學物質不發生交叉反應。單克隆抗體質量穩定每批次見幾乎沒有變化。

2.檢測范圍5μg/L - 500μg/L (ppb) 。通過固相萃取濃縮可以檢測更低的濃度。

3.這個試劑盒有很高的重復性，變異系數在10%之內。

4.操作簡單，整個過程僅花費2.5小時

5.試劑盒的形式是96孔微孔板，可以同時檢測多個樣品，花費合理。

檢測原理 （競爭ELISA）

1. 競爭性反應

這個檢測方法依靠單克隆抗體來識別AP。樣品中的AP和一個AP-酶結合物預先混合然后加入到每個微孔中競爭包被在微孔表面的特異性抗體。樣品中AP的濃度如果高于AP-酶結合物，AP將主要與抗體結合。反之樣品中AP的濃度如果低于于AP-酶結合物，AP-酶結合物將主要與抗體結合。

2. 顯色反應

通過洗滌步驟去除沒有反應的AP和過多的AP-酶結合物。通過加入底物來檢測AP。和微孔板中抗體結合的AP-酶結合物催化底物發生反應產生有色物質。通過一個孵育期用稀酸終止反應。樣品中AP的濃度越高導致結合到微孔板抗體上的AP-酶結合物越少，從而產生的顏色越淡，吸光度越低。

3. 定量分析

利用已知濃度的AP標準的濃度和在450nm條件下獲得的吸光度值做出一條劑量反應曲線（標準曲線）。把樣品的吸光度值用內插法插入到標準曲線中可以精確的計算出樣品中AP的濃度。

AP 檢測流程【乙炔雌二醇檢測試劑盒】

1.樣品處理

在操作前半小時從冰箱中拿出試劑盒使其恢復到室溫（18-25°C）。過濾樣品，加入甲醇和DMSO使甲醇的*終濃度為10% (v/v),DMSO的*終濃度為1%(v/v)。對于一些樣品進行固相萃取是必要的。

2. 標準溶液

利用甲醇溶液（甲醇：水 0.8：8.2）把AP標準濃縮液稀釋10倍。然后對此溶液進一步稀釋成設定的AP標準的濃度（5μg/L- 500μg/L）。在配制的時候先加甲醇溶液后加標準。

3. 抗原-酶結合物溶液

重新配制一瓶抗原-酶結合物溶液：抗原-酶結合物粉末(#3) + 緩沖液(#4, 白蓋).

4. 標準/樣品 與結合物混合

在沒有包被的微孔板中(#8)混合100μL AP標準（或樣品）和100μL酶結合物溶液。先加結合物后加標準或樣品。

5. 競爭反應

在包被抗體的微孔板(#1)的每個孔中加入100μL在第四步中混合的溶液，在室溫(18-25°C)孵育60分鐘。

6. 洗液

用蒸餾水以1：5的比例稀釋洗液（6倍濃縮）：1ml 洗液(#5) + 5ml蒸餾水

7. 沒有結合的物質

每個微孔用300μL的洗液沖洗，并重復兩次。在吸水紙上用力的排板出去微孔中的液體。

8. 顯色

每個微孔加入100μL顯色試劑(#6, 棕色瓶)，在室溫(18-25°C)孵育30分鐘。然后加入每孔再100μL的終止液(#7, 黑蓋)終止反應。

10. 定量

在450nm測定每個標準的吸光度值制作標準曲線。利用內插法把樣品的吸光度值代入標準曲線計算樣品中AP的含量。

所需材料【乙炔雌二醇檢測試劑盒】

必需 – 樣品濃縮時不需要

1.一次性玻璃試管(e.g. IWAKI, item No. 9831-1207)確保要使用一次性試管避免AP的吸附作用

2.玻璃纖維濾器(e.g. ADVANTEC Co., item No. 36481047 Φ47mm)和過濾設備

3.微量加液器(20μL - 200μL 和100μL - 1000μL, e.g. Gilson Pipetman P-200, P-1000)和吸頭

(e.g. ICN Superpack 96NS)

4.排槍(50μL - 300μL)

5.酶標儀（450nm波長）(e.g. TECAN Sunrise Remote)

6.計時器

7.Strip ejector (e.g. COSTAR, No.2578)

8.甲醇Methanol (HPLC grade)

9.DMSO(HPLC grade)

2）必需- 通過SPE 濃縮時需要

n         以上的材料都需要,再加上下面的材料

n         固體萃取柱(e.g. NEXUS SPE Cartridge Producer: VARIAN PART#:1210-3102 ABS ELUT- NEXUS, 200MG 6ML,30/PK)

n         丙酮(HPLC grade)

n         二氯甲烷(analytical reagent)

3、重要性

如果在試驗過程中使用一些沒有使用過的廠家生產的產品試劑時需要做比較試驗。

檢測步驟【乙炔雌二醇檢測試劑盒】

重要性

1.僅用于研究、不用于個人

2.在操作前半小時從冰箱中拿出試劑盒使其恢復到室溫（18-25°C）。

3.不同試劑盒的中的試劑不要混用

4.儲存在2-8 °C

5.不使用過期產品

6.使用完試劑盒后根據當地的法規處理廢液。

7.為了增加準確性推薦在檢測中做兩個重復。

注意

在試驗中要穿保護性衣服，戴手套和眼鏡保證和試劑盒中的液體接觸。

1．樣品前處理

利用特定的玻璃纖維濾紙(1μm 孔徑)過濾水樣，加入DMSO和甲醇使DMSO終濃度為1% (v/v)、甲醇終濃度

為10% (v/v)。如果濾液要求濃縮和清洗需要固相萃取。

例子

1）將上面制備濾液過NEXUS cartridge柱（已經用二氯甲烷(ex. 10ml)、甲醇(ex. 5ml)、蒸餾水(ex. 5ml)提前處理好的），流速10mL/min

2）用蒸餾水(ex. 5ml)和50%蒸餾水/甲醇(ex. 5ml)洗柱。真空干燥柱不超過45分鐘。

3）用二氯甲烷(ex. 6ml)洗脫分析物、然后用氮氣（在30攝氏度或更低的溫度）吹干。

4）加入甲醇和DMSO溶液溶解殘留物，調節溶液的終濃度到1%DMSO和10%甲醇溶液。

2.  標準溶液

制備甲醇溶液（甲醇：蒸餾水=0.8 ml/8.2ml）以備稀釋標準(#2, 10% v/v DMSO, 20% v/v

methanol)使用。利用上面制備的甲醇溶液以1：9的比例稀釋AP標準(#2)來配制設定的AP標準溶液(1% v/v DMSO, 10% v/v methanol)。

1）在配制標準溶液的過程中先加甲醇溶液后加標準(#2)。這樣可以減少AP對試管壁的吸附。

2）推薦使用一次性玻璃試管來稀釋標準，可以減少吸附和污染。

3）如果不經過10倍稀釋儲存液的步驟直接稀釋到設定的標準溶液的濃度，那么標準的真實濃度將要比計劃的濃度要大，所測定的吸光度的值要小0.2-0.5。確保要先稀釋10倍。

4） 在測定前制備AP標準溶液，一旦標準溶液從濃縮的狀態稀釋后就不再穩定了，不易保存很長時間。每個檢測過程都要配制新的標準溶液。

5） 用移液器吸頭混勻，不要渦旋震蕩器用劇烈震蕩來減少樣品中AP對試管壁表面的吸附。

6） 在使用完之后要確保標準濃縮液的蓋擰緊并放在冰箱，標準溶液必須被密封或把蓋擰緊以免甲醇揮

發。

7）保證標準溶液中甲醇的濃度為10%。過高的甲醇濃度可以損害抗體，太低的濃度導致結果讀數不正確。

8）不要隨意處理試驗廢液，要按當地的法規來處理。

3. 抗原-酶結合物

重新配制一瓶抗原-酶結合物溶液：抗原-酶結合物粉末(#3) + 7ml緩沖液(#4, 白蓋)。

1.配制好的溶液要儲存在2-8°C，可以穩定地保存2周。

2.  7mL足夠50個孔使用。

3.         用移液器吸頭混勻，轉移液體時不要產生氣泡。

4.在使用的時候配制。

4. 標準/樣品 與結合物混合

在沒有包被抗體的微孔板中(#8)加入100ul酶結合物溶液，然后再加入100ul在第二步中配制的AP標準溶液或100μL樣品（制備的1% (v/v) DMSO 和10 % (v/v) 的甲醇溶液）。用移液器吸頭混勻。

1.首先加入結合物溶液然后加入標準或樣品避免孔的內表面的非特異性吸附。

2.用移液器吸頭混勻，轉移液體時不要產生氣泡。

3.用1% DMSO 和10%的甲醇溶液做一個空白。

5. 競爭反應【乙炔雌二醇檢測試劑盒】

在包被抗體的微孔板(#1)的每個孔中加入100μL在第四步中混合的溶液，輕輕是震蕩微孔板使其內部的液體混勻，在室溫(18-25°C)孵育60分鐘。

1.包被抗體的酶標板共有12條，每條有8個孔，在檢測前取出所需的孔。然后把不用的再重新放好。

2.在轉移液體時要確保不產生氣泡，因此操作要輕。

3.用膠帶覆蓋微孔板避免污染和液體揮發。

4.在反應期間不要移動和振動微孔

5.溫度控制在18-30°C

6.嚴格反應時間

6. 洗液

用蒸餾水以1：5的比例稀釋洗液（6倍濃縮）(#5)：20ml 洗液(#5) + 100ml蒸餾水 。每次檢測配制所需體積的溶液，每個孔每次要求1.2mL的洗液，整個板需要120 mL。洗液要保存在2-8°C，在配制后大約可以穩定保持一個月的時間。

7. 沒有結合的試劑

每個微孔用300μL的洗液沖洗，并多重復兩次。在吸水紙上用力的拍板除去微孔中的液體。

1.要確保除去任何遺留液體，否則可能引起測量錯誤。

2.確保微孔板底部干凈，不要有手印或其它污垢，否則吸光度將有很大改變。

3.不要傾倒任何沒有處理的廢液，例如：浸泡的布或紙要燃燒掉。

8. 顯色反應

在每個微孔中加入100ul顯色液(#6, brown vessel)。在室溫下孵育30min。然后每個微孔加入100ul終止液(#7,黑蓋)終止反應。

1.孵育溫度控制在18-30°C

2.要使每個孔的反應時間一致，尤其在測試多個樣品的時候

3.加入終止液后孔中的藍色轉變為黃色

9. 定量【乙炔雌二醇檢測試劑盒】

在450nm用酶標儀測定每個標準和樣品的吸光度值。

1.在終止反應15分鐘內測定吸光度值。

2.每次檢測制作標準曲線的標準至少做兩個重復。

3.確保微孔底面沒有手印和污物，否則測定的吸光度值有很大的改變。

4.樣品的檢測范圍5μg/L - 500μg/L，樣品中AP的濃度超過500μg/L時要用10%甲醇+1% DMSO稀釋后再測定。對于完全不知情的樣品做前處理時要做遠不止一倍的稀釋。

計算樣品中AP濃度的方法

（1）電腦計算

利用酶標儀分析軟件，用Log-Log (or Log-Linear)曲線。

（2）利用附帶的曲線圖計算

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