胚胎生殖細胞是精子和卵細胞在胚胎期的前體細胞，其正常發育對于遺傳信息在親代與子代之間的穩定傳遞以及物種延續起著至關重要的作用。對人類胚胎期生殖細胞發育進程的深入研究能夠促進我們對于生殖細胞發育異常、不孕不育等相關疾病的了解與治療。在過去幾年中，湯富酬課題組與喬杰課題組一直緊密合作，運用微量細胞 DNA 甲基化組高通量測序和單細胞轉錄組高通量測序等技術，首次在單堿基分辨率和全基因組水平，全面揭示了人類胚胎生殖細胞在多個關鍵發育階段的大規模 DNA 甲基化組重編程過程、及其對基因表達的調控關系，并且發現了人類胚胎生殖細胞不同于小鼠胚胎生殖細胞的關鍵獨特特征。他們發現在 DNA 甲基化組重編程過程中，DNA 甲基化與基因轉錄調控發生脫扣，這樣 DNA 甲基化在被大規模擦除過程中基因的轉錄基本不受影響，各種組蛋白共價修飾在此期間維持著轉錄組的高度穩定性。相關研究成果以封面文章的形式發表在 2015 年 6 月的《Cell》雜志上。在此基礎上，兩個課題組繼續深入研究，采用優化的微量細胞 NOMe-seq（全基因組核小體定位及 DNA 甲基化組測序）技術，系統分析了人類胚胎生殖細胞多個關鍵發育階段的染色質狀態組的動態變化。作為對照，他們也系統分析了對應發育階段的小鼠胚胎生殖細胞的染色質狀態組的動態變化。通過進化比對分析，揭示了人類和小鼠胚胎生殖細胞染色質狀態組、DNA 甲基化組參與基因表達調控的進化保守性特征以及物種特異性特征。他們還發現了十幾萬個人類生殖細胞胚胎階段特異性的開放染色質區域，推測其中大部分為全新的人類胚胎生殖細胞特異性激活的增強子調控元件，這為解析增強子對于人類生殖細胞體內發育的調控機理打下了堅實的基礎。相關研究成果已在線發表在 2016 年 11 月的《Cell Research》雜志上。雖然該研究團隊 2015 年 6 月發表在《Cell》上的文章中已經對人類胚胎生殖細胞及其微環境細胞的三百多個單細胞進行了轉錄組分析，但是胚胎生殖細胞精確的發育歷程，特別是減數分裂階段的發育異質性和核心基因表達特征還沒有被闡明。

圖 2：人類胚胎生殖細胞的發育過程概覽。

在上述研究的基礎上，湯富酬研究組與喬杰研究組繼續深入合作，運用免疫磁珠細胞分離技術（MACS）、流式細胞分選技術（FACS）、以及優化了的單細胞轉錄組高通量測序技術對從妊娠 4 周到 26 周的人類胚胎生殖細胞及其微環境細胞的兩千多個單細胞進行了系統的轉錄組測序分析，并通過后續的功能實驗對性腺中生殖細胞的分布與定位、以及細胞亞群的精確比例關系等關鍵特征進行了系統的分析。該項研究發現：

（一）定植到性腺后，人類雌性胚胎生殖細胞經歷四個關鍵的發育階段：（1） 有絲分裂階段、（2） 視黃酸信號響應階段、（3） 減數分裂前期階段、（4） 原始卵泡生成階段。定植到性腺后，人類雄性胚胎生殖細胞經歷兩個關鍵的發育階段：（1） 有絲分裂階段、（2） 有絲分裂阻滯階段。有趣的是，妊娠后 18 周的胚胎卵巢中就已經開始出現原始卵泡階段的生殖細胞，并且在從 18 周到 26 周的胚胎卵巢中，從早期有絲分裂階段直到晚期原始卵泡階段所有四個發育階段的生殖細胞在同一個性腺中共存。類似的，從 13 周到 25 周的胚胎睪丸中，早期有絲分裂階段和晚期有絲分裂阻滯階段的生殖細胞在同一個性腺中共存。這表明人類胚胎生殖細胞的發育進程在時間上是不同步的，會經過一個復雜而有序的異步發育過程。

（二）準確鑒定出了人類胚胎雌性性腺中的 4 種關鍵類型的微環境細胞：性腺內皮細胞、早期顆粒細胞、晚期顆粒細胞、以及壁顆粒細胞。同時也準確鑒定出了人類胚胎雄性性腺中的 4 種關鍵類型的微環境細胞：性腺內皮細胞、支持細胞、間質前體細胞、以及成熟間質細胞。在此基礎上，系統鑒定了這 8 種性腺微環境細胞的轉錄特征，表面標志，信號通路活性，以及核心轉錄因子網絡。

（三）在單細胞水平系統分析了以上各種類型性腺細胞在發育過程中重要的基因表達模式，并且運用 ARACNe （the Algorithm for the Reconstruction of Accurate Cellular Networks） 方法分析鑒定出在各個關鍵發育階段雌性和雄性生殖細胞中可能起核心調控作用的轉錄因子網絡。例如，MALE 和 ZGLP1 在視黃酸信號響應階段的雌性生殖細胞中可能起關鍵調控作用；FIGLA 和 STAT1 對于原始卵泡生成階段的雌性生殖細胞的發育可能至關重要。

（四）準確鑒定出人類胚胎生殖細胞與性腺微環境細胞之間通過 BMP 和 NOTCH 等信號通路進行相互調控，協同維持性腺發育的穩定性和連續性。特別是該研究發現在同一個胚胎中的早期階段生殖細胞與晚期階段生殖細胞之間通過 NORDAL 等信號通路相互作用，共同維持二者之間的動態平衡。

（五）視黃酸信號通路的精確調控對于生殖細胞進入減數分裂至關重要。通過對視黃酸信號通路中的相關基因表達進行系統的分析，該研究首次發現：合成視黃酸的基因 RDH10 在雌性生殖細胞中的表達水平明顯高于雄性生殖細胞，降解視黃酸的基因 CYP26A1 在視黃酸信號響應階段和減數分裂前期階段的雌性生殖細胞中上調。該研究表明視黃酸的快速合成與及時降解之間的精確動態平衡對于人類雌性生殖細胞進入減數分裂起重要調控作用。

（六）通過對與細胞周期阻滯相關基因的表達情況進行分析，該研究發現 NANOS2，CDKN2B 和 CDK6 等基因對于人類胚胎期雄性生殖細胞進入有絲分裂阻滯階段可能起關鍵調控作用。

（七）運用免疫熒光染色技術對 18 周人類胚胎卵巢組織中的四種主要類型生殖細胞進行分析發現：隨著發育的進行，人類胚胎生殖細胞的大小會逐漸增大，由有絲分裂階段的 8 -10 μm 到原始卵泡發生階段的 23-28 μm；有絲分裂期和視黃酸信號響應期的胚胎生殖細胞大多分布在卵巢皮質的周邊區域，減數分裂前期和原始卵泡生成期的胚胎生殖細胞的分布則更靠近卵巢中心（髓質）的區域；四種胚胎生殖細胞數量的比例依次是 25%，40%，25%，10%。而 18 周的胚胎睪丸組織中有絲分裂階段和分裂阻滯階段的生殖細胞的比例分別為 40% 和 60%。

該研究對人類胚胎生殖細胞在妊娠 4 周到 26 周的長達五個月的發育關鍵期的轉錄組進行了全面、系統、深入的解析與闡釋，深化了對于人類生殖系細胞的有絲分裂、減數分裂、卵泡發生、細胞遷移、性別分化、生殖細胞 - 微環境細胞互作等一系列關鍵的生殖生物學過程的理解；特別是加深了對于生殖系 - 非生殖系細胞在性腺發育過程中的互動與協同調控機理的理解。

該研究對高度動態但又精確協調的核心轉錄因子以及信號通路的解析為多能性干細胞體外定向分化為生殖細胞研究提供了非常有價值的線索。該項研究描繪的體內正常生理情況下人類胚胎生殖細胞的發育歷程將為生殖細胞相關疾�。ㄈ绮辉胁挥�和畸胎瘤等）的診斷和治療提供路標。北京大學生命科學學院博士生李莉、董驥和北醫三院生殖中心閆麗盈博士為該論文的并列作者。湯富酬研究員和喬杰教授為該論文的共同通訊作者。該項研究得到了國家自然科學基金、國家基礎研究計劃、北京市科學技術委員會、國家高技術研究發展計劃、北京未來基因診斷高精尖創新中心、以及北大 - 清華生命科學聯合中心的資助。

圖 3：人類雌性胚胎生殖細胞動態基因表達模式。

圖 4：人類雄性胚胎生殖細胞動態基因表達模式