眾所周知，蛋白質的翻譯后修飾（PTM）對于增加蛋白質組的功能多樣性，以及調節蛋白質亞基的水解或者整個蛋白質的水解至關重要，因此探索蛋白質翻譯后修飾在細胞生物學以及疾病預防和治療方面意義重大。大自然神奇之手讓酶和底物相互作用相互識別，并毫無偏差的對蛋白質進行定點修飾，從而控制著功能開關的開啟與關閉。人類之手能不能模仿進化了數億年的生物化學修飾呢？近期，牛津大學Benjamin G. Davis小組在JACS上刊文用純化學手段證明了這一策略的可行性。（Selective Metal-Site-Guided Arylation of Proteins. J. Am. Chem. Soc., 2016,138, 8678-8681, DOI: 10.1021/jacs.6b04043）

傳統上對蛋白質化學修飾方法主要依賴于蛋白質上某一特定殘基的化學選擇性，比如賴氨酸的氨基或者半胱氨酸的巰基都具有一定的親核性從而與某些親電試劑加成。這種修飾方法簡單粗暴所以會導致多位點修飾的副產物，如何對某一特定位點殘基選擇性修飾就是一個問題。一個常用的解決方法是利用酶或者化學方法將某些非天然氨基酸（UAA）導入到蛋白質特定位置上，這些非天然氨基酸帶有具有“正交試驗”活性的基團從而大大提高了化學選擇性。雖然有報道利用非天然氨基酸側鏈與金屬的螯合來實現蛋白質的修飾，但利用蛋白質上天然存在的氨基酸殘基作為導向基團進行特定位點修飾卻鮮有報道。

Davis小組的設計思路基于金屬離子導向的蛋白質定點修飾，就像人的兩只手，左手（金屬離子）抓住蛋白質上特定具有螯合配體性質的位點（靶向性），右手（待修飾小分子化合物）與配體附近的氨基酸殘基反應進行化學修飾（反應活性）。自然界中不乏用金屬離子作為輔因子的酶（如紅素氧還蛋白、過氧化物歧化酶等），作者選擇用金屬離子依賴性A類糖基轉移酶（GTs）中的甘露糖基甘油酸合酶（MGS）作為模型系統。GT-A類酶有一DxD序列作為金屬螯合位點，具體到MGS的位點為D100A101D102，作者假設這三個位點可以被用作金屬-芳基化合物的結合位點，繼而將芳基轉移到鄰近的氨基酸殘基（如233位半胱氨酸殘基Cys233）上。

說干就干，首先，作者用活性較高的碘苯作為待修飾小分子，并選用鈀催化劑（水相反應活性較好）作為金屬螯合劑，*終確定Pd(OAc)2（并用DM-ADHP作為配體）效果（65 °C）。值得一說的是，大牛Buchwald去年也在Nature上報道過用鈀催化劑對蛋白質半胱氨酸巰基進行芳基修飾（點擊這里閱讀）。LC-MS證明只有單取代修飾產物生成，用內消化酶水解蛋白質并用LC-MS/MS分析確定修飾位點位于233位半胱氨酸殘基（Cys233）。并沒有影響其他位點的半胱氨酸殘基（如Cys34、Cys209、Cys305），特別是暴露出來的位阻較小的Cys305并沒有被修飾。

接下來作者從各個方面證明了螯合位點和反應位點的缺一不可。首先，作者對其中的某些半胱氨酸突變成丙氨酸殘基（C34A、C209A、C233A），結果證明只有當233位Cys殘基突變成Ala時（C233A），沒有修飾產物生成，說明反應位點只在Cys233。另一方面，丙氨酸掃描突變分析技術（Ala-scanning mutational analysis）顯示D100、D102以及T139氨基酸殘基對于金屬離子螯合影響（雖然不是全部），證明了導向氨基酸殘基部位對于定點修飾的重要性。

得到這些證據后，作者擴大了待修飾小分子底物范圍，結果顯示對各種芳香環的兼容性都很好，如帶有click把手的化合物12、13；帶有生物素把手的化合物14，這對于后期的熒光檢測或者親和色譜分離都非常具有優勢。

*后，作者用此方法在細胞裂解液釣出了另一條大魚——chaperonin GroEL（用帶有生物素的芳基化合物14），此酶參與蛋白質生物合成的*后幾步，并已知此酶的天冬氨酸殘基部分參與Mg離子的結合而發揮作用。

小小僧點評：

1）成果很漂亮，證明了蛋白質的金屬離子結合位點可以作為化學修飾的導向基團，具有很高的特異性，工作做得非常完善。2）是否只能用于某些特定蛋白質（具有金屬離子螯合位點）的檢測、分離？3）反應條件是否需要進一步優化？畢竟不是所有蛋白質在65°C都能穩定。