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技術文章
還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）試劑盒資料
產品說明書（中文版）
試劑盒用途
還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過乳酸脫氫酶反應系統測定細胞或組織樣品中的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的含量，即采用比色法測定其氧化后峰值的變化，進行濃度測算的權威而經典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞或組織裂解懸液樣品（動物、人體、植物、昆蟲等）還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。
技術背景
還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）是糖酵解通路中通過轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）而產生乙醇所必須的輔助因子，是細胞生理學中能量代謝、脂肪酸代謝和糖代謝的重要因子。通常乳酸脫氫酶反應系統被用于測定NADH（340nm 波長）的濃度，其反應方式為：
丙酮酸+ NADH← 乳酸 脫氫酶→乳酸+ NADH+
（高吸收峰）（低吸收峰）
產品內容
緩沖液（Reagent A）毫升
反應液（Reagent B）毫升
酶促液（Reagent C）微升
陰性液（Reagent D）毫升
產品說明書1 份
保存方式
保存 反應液（Reagent B）和 酶促液（Reagent C）在－20℃冰箱里；其余的保存在 4℃
冰箱里； 反應液（Reagent B）避免光照；有效保證 6 月
用戶自備
1.5 毫升離心管：用于反應液配制的容器比色皿：用于比色的容器分光光度儀：用于比色分析
酶標儀：用于微量樣品比色分析
實驗步驟
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 反應液（Reagent B）和 酶促液（Reagent C）
置入冰槽里融化； 反應液（Reagent B）避免光照。然后進行下列操作。
一、 測定準備
1． 準備好待測 NADH 的樣品（例如細胞或組織裂解懸液樣品等），置于冰槽里
2． 設定好分光光度儀（溫度為 25℃）：波長 340nm，設置 0 分鐘和 5 分鐘各測讀 1 次，并置零
| 二、 背景對照測定 |
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| 1． 移取 | 微升 緩沖液（Reagent | A）到新的比色皿 |
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| 2． 加入 | 微升 反應液（Reagent | B） |
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| 3． 加入 | 微升 酶促液（Reagent | C） |
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| 4． 置于 25℃溫度下孵育 5 分鐘，避免光照 |
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| 5． 放進分光光度儀，置零 |
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| 6． 取出比色皿 |
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| 7． 加入 | 微升 陰性液（Reagent | D） |
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| 8． 上下傾倒數次，混勻（限定在 3 秒之內） |
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| 9． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（0 分鐘讀數－5 分鐘讀數） |
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| 三、 樣品測定 |
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| 1． 移取 | 微升 緩沖液（Reagent | A）到新的比色皿 |
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| 2． 加入 | 微升 反應液（Reagent | B） |
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| 3． 加入 | 微升 酶促液（Reagent | C） |
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| 4． 置于 25℃溫度下孵育 5 分鐘，避免光照 |
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| 5． 放進分光光度儀，置零 |
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| 6． 取出比色皿 |
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| 7． 加入 100 微升（20 微克總蛋白）待測樣品（注意：樣品須清澈） |
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| 8． 上下傾倒數次，混勻（限定在 3 秒之內） |
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| 9． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（0 分鐘讀數－5 分鐘讀數） |
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| 10．（選擇步驟）重復實驗步驟 1 至 9，測讀新的樣品 |
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| 四、計算樣品濃度 |
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| （樣品讀數 − 背景對照讀數 ）× 樣品稀釋倍數 |
| = | 物質的量濃度 • μmol ⋅ ml−1 | = 樣品濃度 • μmol ⋅ mg | −1 | |
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| 0.1ml（樣品容量 ） × 6.22（毫摩爾吸光系數 ） |
| 質量濃度濃度 • mg ⋅ ml-1 |
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| 五、酶標板測定 |
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| 1． 在 96 孔酶標板上做好相應標記：背景對照和待測樣品 |
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| 2． 分別移取 | 微升 緩沖液（Reagent | A）到相應孔中 |
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| 3． 分別加入 | 微升 反應液（Reagent | B） |
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| 4． 分別加入 | 微升 酶促液（Reagent | C） |
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5． 輕輕搖動酶標板，混勻
| 6． 置于 25℃溫度下孵育 5 分鐘，避免光照 |
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| 7． 分別加入 | 微升 陰性液（Reagent | D）和待測樣品（10 微克總蛋白） |
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| 8． 輕輕搖動酶標板，混勻 |
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| 9． 即刻放進酶標儀檢測：0 分鐘讀數和 5 分鐘讀數 |
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| 10．濃度計算： |
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| （樣品讀數 − 背景對照讀數 ）× 樣品稀釋倍數 | = | 物質的量濃度 • μmol ⋅ ml−1 | = 樣品濃度 • μmol ⋅ mg | −1 | |
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| 0.025ml （樣品容量 ） × 6.22（毫摩爾吸光系數 ）× 0.5 | 質量濃度濃度 • mg ⋅ ml-1 |
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注意事項
1． 本產品為 21 次（比色皿）和 80 次（酶標板）操作，包括背景對照
2． 操作時，須戴手套
3． 系統操作過程中，背景測定只需 1 次
4． 樣品須澄清，至關重要
5． 孵育時，避免光照
6． 加樣后即刻比色測定
7． 反應 1 分鐘后比色測定值趨于穩定；測定值由高到低變化；測定持續 5 分鐘（終點測定）
8． 比色測定后，比色皿須清洗徹底
9． 建議待測樣本的 OD340 為 0.2 至 0.8 為理想狀態
10．如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
11．本公司提供系列細胞生化檢測試劑產品
質量標準
1． 本產品經鑒定性能穩定
2． 本產品經鑒定檢測敏感
原創作者：齊一生物科技（上海）有限公司
