旦準備好，樣品蛋白質通過 PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離，這可以在天然或變性條件下進行。蛋白質印跡指南的這部分詳細介紹了您在分離蛋白質時可能需要考慮的事項。

SDS-PAGE 通常用于蛋白質印跡，其中蛋白質被變性和還原以獲得它們的初結構。用 SDS 分子（十二烷基硫酸鈉）包被會產生與其分子量成正比的相對負電荷，從而允許僅按大小分離蛋白質。Native PAGE 省略了 SDS 的使用，用于觀察不同的蛋白質特征。它很少通過蛋白質印跡進步處理，更常見的是用考馬斯或銀染色。天然 PAGE 中的蛋白質遷移率取決于電荷和流體動力學大小，這由多肽折疊決定。以特定方式折疊的小蛋白質可能比更大、更緊密折疊的多肽具有更大的流體動力學尺寸。此外，可以保留多聚體結構。

SDS-PAGE 是通過將蛋白質引入丙烯酰胺凝膠基質并施加電流將帶負電荷的蛋白質拉過凝膠來進行的。丙烯酰胺凝膠基質的密度阻礙了蛋白質的轉運。較小的蛋白質比較大的蛋白質更快地通過凝膠，在電泳期間通過凝膠更遠，并且看起來更接近凝膠的末端。相反，較大的蛋白質抵抗遷移并保持更接近凝膠的開始。包含已知大小蛋白質的蛋白質標記可以與樣品同時加載，以校準分離蛋白質的大小。

也可以使用其他類型的凝膠，這些凝膠通過大小以外的特性分離蛋白質。例如，等電聚焦凝膠 (IEF) 凝膠根據蛋白質的等電點 (pI) 分離蛋白質，該等電點對應于蛋白質不帶凈電荷的 pH 值。除了凝膠本身之外，這些其他類型的凝膠通常還需要門的緩沖液和分子量標記。

將蛋白質樣品裝入樣品孔中，在夾在兩個緩沖液室之間的聚丙烯酰胺凝膠中形成細齒。垂直電泳儀如圖 1 所示。

個室連接到陰J，樣品加載孔暴露在此處，第二個室連接到凝膠末端的陽J。施加電壓，蛋白質通過凝膠向陽J移動。 

蛋白質大小和凝膠基質的密度決定了分離的速度；較小的蛋白質比較大的蛋白質遷移得更快。

準確的蛋白質鑒定和定量需要高質量的分離。必須使用適當的凝膠特性和上樣濃度來確保充分分離。

Jackson公司：聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠用作分離基質。

堅固、親水、熱穩定、透明和相對化學惰性，這確保了在過程中不會破裂或熔化，并且蛋白質很容易觀察到。

化學反應不會干擾蛋白質遷移，并且由凝膠密度控制的孔徑可以變化。

不連續聚丙烯酰胺凝膠

PAGE 中使用的大多數凝膠由兩個凝膠區域形成：由較低密度凝膠制成的濃縮凝膠和較高密度的分離凝膠。

較小的蛋白質通過濃縮膠快速遷移，并阻礙了通過分離膠的遷移。

較大的蛋白質通過濃縮膠緩慢遷移，可能不會滲透到分離膠中。

梯度凝膠

梯度凝膠用于允許在同測定中分離不同分子量范圍的蛋白質，從而允許從同樣品中分離低分子量和高分子量蛋白質。凝膠的選擇取決于所需的蛋白質分離。

聚合和澆注凝膠

聚丙烯酰胺凝膠是通過化學或光引發聚合丙烯酰胺單體和 N,N＇-亞甲基-雙丙烯酰胺交聯劑的溶液制成的。聚合的化學引發使用過硫酸銨等化合物引發反應，使用 N,N,N＇,N＇-四亞甲基二胺等化合物來穩定鏈式反應。聚合的光引發使用核黃素，將其添加到溶液中并暴露在玻璃板之間的長波紫外線下，并用水飽和的丁醇覆蓋。這不包括抑制鏈式反應的分子氧。

凝膠的密度由丙烯酰胺單體和雙丙烯酰胺交聯劑的濃度決定。增加丙烯酰胺濃度會增加凝膠密度。有多種厚度的預制凝膠可供選擇，但手工澆注凝膠是博士學位。通過儀式。

高分子量蛋白質

PAGE 可用于分離 5 至 200 kDa 的蛋白質。對于大分子量蛋白質（700–4,200 kDa），瓊脂糖凝膠比聚丙烯酰胺凝膠提供更好的分離。（表）

Jackson公司：緩沖液 pH

pH 影響蛋白質遷移；因此，運行緩沖液的 pH 值必須高于蛋白質的等電點，以保持其凈負電荷，因此它們向陽J移動。連續密度凝膠在兩個腔室中使用相同的緩沖液，而不連續凝膠則需要不連續的緩沖系統。通常使用 Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠 pH 值約為 7.0，分離膠 pH 值介于 8.0 和 9.0 之間。需要時可以使用其他門的緩沖系統。例如，在分離J低分子量的蛋白質/肽時，Tricine 緩沖液是理想的選擇。

在高 pH 分離凝膠中，半胱氨酸殘基之間可以形成二硫鍵。為了解決這個問題，可以將還原劑添加到緩沖液中。如果正在執行天然 PAGE，則可以添加緩沖范圍為 7.4 至 8.8 的兩性離子氨基酸，例如曲辛堿，作為替代溶液。

Jackson公司：用分子量標記確定蛋白質大小

蛋白質大小根據分子量標記進行校準。這些由系列具有已知分子量的蛋白質組成，這些蛋白質與樣品同時在平行通道中運行。

未知多肽的分子量可以通過計算標記物的相對遷移距離 (Rf) 與感興趣的蛋白質行進的距離相比較來估計。分子量標記也是蛋白質轉移效率的有用指標。

預染分子量標記可用于監測電泳過程中蛋白質遷移的進程。在添加免疫試劑之，還可以通過用染料（例如麗春紅 S）暫時染色膜來觀察標記物。如果凝膠不進行免疫印跡，可以在電泳后用考馬斯亮藍或銀染色來觀察未標記的標記物。（表二）

陰性組織對照

陰性對照使用已知不表達靶蛋白的細胞或組織樣本。當這些與未知樣品起運行時，不應檢測到與目標蛋白大小相同的對照帶。運行陰性對照以識別抗的非特異性檢測。陰性對照信號表明抗與樣品中的蛋白質相互作用，而不是感興趣的蛋白質，例如培養過程中產生的內源性蛋白質。

另種有用的陰性對照是免疫印跡，其中抗被排除在外，通常稱為無抗對照。此類對照中的陽性信號表明二抗與樣品中的蛋白質直接結合。例如，如果樣品中含有小鼠 IgG，則使用小鼠組織樣品的蛋白質印跡可能會產生陽性信號，這將被抗小鼠 HRP 偶聯的二抗檢測到。

加載控件

上樣對照用于評估 PAGE 的致性，它們產生的信號可用于在定量過程中使孔之間的測定結果標準化。

上樣控制的種形式是測量來自每個樣品中摻入的蛋白質的信號。這可用于確認在電印跡過程中從凝膠均勻轉移到膜上，并可用于在分析過程中使孔之間的信號標準化。在組成樣品的組織或細胞中表達的管家蛋白，例如肌動蛋白，可用作上樣對照。特別是，他們確認孔中裝載了相同數量的樣品，并且可以識別樣品處理差異。

Jackson公司注于親和純化的二抗和純化免疫球蛋白研究，服務域覆蓋各大學科研所和醫院里的動物研究以及生物醫學研究機構的科學家。艾美捷科技是Jackson公司的中國代理商，為科研工作者提供優質的產品與服務。

來源：https://www.amyjet.com/brand/jackson-china-distributor.shtml