化學發光蛋白質印跡法是種高靈敏度的蛋白質檢測方法。寬動態范圍允許在很寬的蛋白質濃度范圍內進行分析物檢測。報告酶的線性響應與增強的化學發光 (ECL) 底物相結合，使檢測方法適用于定量分析。

當與適當的化學發光底物結合時，報告酶偶聯二抗可用于化學發光檢測。如下圖中所述，報告酶催化化學發光底物轉化為發光產物。然后使用電荷耦合器件 (CCD) 數碼相機或 X 射線膠片捕獲光，從而識別感興趣的蛋白質。

這期的主題是Jackson ImmunoResearch公司為大家講解：化學發光免疫印跡。

圖 ：化學發光檢測。A.酶聯二抗與目的蛋白的抗結合。B. 將化學發光底物添加到抗體-抗原復合物中。C.報告酶將底物催化成發光產物，信號可以通過（CCD）數字成像儀或X射線膠片檢測。

：信號穩定性

分析物的信號輸出是瞬態的，僅在酶-底物反應期間產生。信號會在底物耗盡時衰減，盡管酶會保持活性。在某些情況下，底物可持續長達 24 小時，但在分析物濃度高的情況下，信號輸出可能只有幾分鐘。如果需要，可以通過添加新底物來刷新分析物信號。

為了優化信號到背景捕獲并避免信號飽和，可能需要多次曝光。如果使用 X 射線膠片，在抗原低或抗親和力差的情況下，顯影可能需要 24 小時曝光，并且在優化過程中可能會使用許多膠片。數字成像通過 5 到 5 分鐘之間的信號捕獲簡化了曝光優化，并且可以以少的資源或時間浪費生成圖像。

二、定量

報告酶對 ECL 底物催化的線性特性使其成為定量蛋白質印跡的理想選擇。Image J 和 Image Quant 是許多圖像分析軟件之，可用于評估分析物帶相對于對照帶的密度（光密度），從而得出分析物的相對數量。

必須設置印跡，以使檢測不在飽和J限，由實驗試劑的滴定確定。必須包括加載控制，并且必須補償背景信號。應該注意的是，如果需要非常準確的定量，使用標準曲線的 ELISA 可能更適用。

三、靈敏度

化學發光檢測非常靈敏，皮克量的檢測經常被報道。通過優化，可以檢測到飛克量的分析物�？梢允褂镁哂胁煌`敏度的化學發光底物，并且底物的選擇可能取決于分析物的豐度。

多路復用——在同個印跡上檢測多種分析物

當蛋白質具有多個標簽時，在同印跡上檢測多個蛋白質可能有助于測試蛋白質表達，例如用于純化的 His6 和用于檢測的更敏感的 FLAG。如果由于截斷、蛋白水解或初錯誤導致個初沒有檢測到樣品中的標簽，研究人員可以探測第二個標簽以確認表達。

化學發光蛋白質印跡不能進行多重檢測，但可以使用剝離緩沖液剝離它們并用另對抗體重新探測。剝離緩沖液通常很苛刻，可能會改變第二次初獲得的信號，因此不建議將剝離的印跡用于定量分析。熒光蛋白質印跡為檢測多種抗原提供了種更加可靠的方法——了解更多關于熒光蛋白質印跡的信息。

四、Jackson公司：辣根過氧化物酶偶聯物

報告酶辣根過氧化物酶 (HRP) 是種流行的二抗偶聯物。與過氧化物緩沖液結合，HRP 將化學發光底物魯米諾氧化為其激發態產物 3-氨基鄰苯二甲酸酯。該產品在衰減到其基態時會發出 425 nm 的光，該信號可以被 X 射線膠片或 CCD 相機捕獲。

有關 JIR 過氧化物酶偶聯物的更多信息，請單擊此處

五、Jackson公司：堿性磷酸酶偶聯物

堿性磷酸酶可用于化學發光檢測，底物為二鈉-氯-5-(4-甲氧基螺{1,2-二氧雜環丁烷-3,2＇-(5＇-氯)三環癸烷}-4-基)-1-苯基磷酸鹽），它被 AP 去磷酸化，產生亞穩態的苯酚二氧雜環丁烷陰離子，該陰離子在 466 nm 處發光（Schaap 等人 1989）。發射的光穩定長達 24 小時，允許多次曝光 X 射線膠片。

辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶偶聯物是適用于所有免疫技術的敏感試劑。

文獻參考：

A E Kalyuzhny A (2016) Immunohistochemistry – Essential Elements ａnd Beyond.  Springer International Publishing Switzerland.

A P Schaap, H Akhavan ａnd L J Romano (1863) Chemiluminescent substrates for alkaline phosphatase: application to ultrasensitive enzyme-linked immunoassays ａnd DNA probes. Clinical Chemistry Sep 1989, 35 (9) 1863-1864;

Jackson公司注于親和純化的二抗和純化免疫球蛋白研究，服務域覆蓋各大學科研所和醫院里的動物研究以及生物醫學研究機構的科學家。艾美捷科技是Jackson公司的中國代理商，為科研工作者提供優質的產品與服務。

來源：https://www.amyjet.com/brand/jackson-china-distributor.shtml