1、如何驗證抗在CUT&RUN中起作用？

對于CUT＆RUN實驗，驗證數據可以包括例如 Tapestation或Bionalyzer圖顯示大小分布，qPCR數據顯示靶標富集。由于CUT&RUN的樣本量較低，獲得的DNA也相對較少，對于低豐度的靶蛋白，濃度通常太低而無法使用熒光測定法或毛細管電泳測量，所以需要選擇高靈敏度的Qubit 或 Nanoｄrop fluorometer以及Tapestation或Bionalyzer。如果獲得的DNA＜50bp ，PCR擴增是無法進行的。旦產生了測序文庫并進行了測序圖測序，就可以讀取并驗證讀取在已知結合位點的積累。

2、實驗中是否需要使用二抗？

二抗的使用取決于抗體和pA/G-MNase融合蛋白的宿主和亞型，對于pA / G-MNase結合，可能是需要的。蛋白A對所有兔IgG抗體具有良好的高親和力，但對大鼠，山羊和綿羊IgG同種型抗體以及某些小鼠IgG抗體亞類（尤其是IgG1）具有低親和力。另方面，蛋白G與小鼠，山羊，綿羊和大多數大鼠IgG的Fc區結合良好。但是，它對兔IgG的親和力低于蛋白A。當使用我們改進后的CUT＆RUN 方案時通常不需要二抗。原始的方案則需要二抗來確保融合蛋白與抗體的有效結合。

3、CUN&RUN是否可改造適用于RIP-seq?

改善CUT&RUN的操作步驟作用在RNA上，以作為RIP-seq的替代方案是有可能可以實現的。細胞質中的RNA如果缺乏5‘cap和3‘poly-A則易被降解，因此建議選用細胞核作為樣本。由于核被膜不含膽固醇，所以不需要使用dignitonin。分離出來的細胞核可通過核被膜上的糖蛋白固定在ConA磁珠上，再加入抗體識別目的蛋白，然后加入pA/G-MNase靶向到抗體上，從而切割RNA。zui后將RNA分離出來轉錄成cDNA并進行測序和定位。

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來源：https://www.amyjet.com/featured/cutrun-2.shtml