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              技術研究進展治療性CRISPR/cas9

              點擊次數:374 發布時間:2017/1/5
               有目標性位點的靶向核酸酶被廣泛用于基因組編輯。2013 年次將 Crispr/cas9 技術用于基因組編輯以來,這個領域發生革命性的變化。作為基因組編輯工具,Crispr/cas9 *成功的地方是它可以輕松的設計向導性 RNA 序列將 Cas9 引導到基因組的特定位點上,然后通過 Cas9 的核酸酶切割活性造成 DNA 斷裂。*近的幾項研究,成功地應用 Crispr/cas9 糾正動物模型,體細胞和體外誘導的多能干細胞中引起疾病的突變基因,這也對基因組編輯技術應用于臨床燃起了希望。我們對近期應用 Crispr/cas9 技術用于基因治療研究做一綜述。
               
               
               
              規律成簇間隔短回文重復序列( CRISPRs )配合與它相關的Cas蛋白賦予細菌或古生菌防御外源入侵的核酸,如噬菌體和質粒 DNA[1]。目前為止已經發現的 Crispr/cas9 系統有三種類型,研究得*為透徹的是第二種類型[2]。在細菌防御反應中,外源性DNA會被切割成很多小段,插入到CRISPR位點旁,然后被轉錄成Cr-RNA前體,繼續通過剪切變成成熟的 Cr-RNA 。相應的反義鏈上會經過轉錄和轉錄后加工,形成一個互補的 traCr-RNA ,跟Cas9核酸酶形成核蛋白復合體繼續識別和切割入侵的外源 DNA[2]。2012 年,Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer Doudna 用二型 Crispr/cas9 技術對釀膿鏈球菌基因組進行編輯[3]。Cr-RNA 和 traCr-RNA 形成一個向導性的 sgRNA,通過 Watson-Crick 互補配對原則定位到基因組特定位點,招募Cas9核酸酶過來切割 DNA,造成 DNA 雙鏈斷裂反應( DSB )[3, 4]。Crispr/Cas9復合體通過兩種不同的機制對基因組進行編輯。種方式是在缺少同源性DNA模板時,DSB 損傷修復主要是通過非同源末端連接( NHEJ ),這是一種容忍差錯的修復,會引起小的插入和缺失。第二種方式是在同源性 DNA 模板存在情況下,通過同源重組的方法進行精確修復,也可以對特定的核苷酸序列進行替換(如圖1所示)[5, 6]。
               
              在 Crispr/cas9 之前,主要是用鋅指核酸酶和 TALEN 技術進行 DNA 編輯。但是,涉及這種特異性識別DNA序列的蛋白基序非常耗時,這嚴重影響了技術的發展[7, 8]。Crispr/cas9技術具有鋅指核酸酶和TALEN技術無法比擬的可操作性,廣泛應用于各種物種的DNA編輯,包括人和靈長動物[9-12]。這些研究表明 Crispr/Cas9 有望應用于基因治療,可以改變引起疾病的基因的核酸序列。我們對*近應用 Crispr/cas9 技術用于基因治療研究做一歸納。首先介紹一下,體內條件下,Crispr/cas9 直接針對受精卵和成體動物(如圖 2A 所示)。再綜述一下,通過體外培養細胞,用 Crispr/Cas9 體外敲除基因,這這些修飾過的細胞回輸入病人體內,成功控制病人疾病的案例(如圖 2B 所示)。
               
               
               
              1.Crispr/cas9對受精卵基因組編輯
               
              共同注射 Cas9 的信使 RNA 或者蛋白,sgRNA 和 HDR 模板到受精卵或早期胚胎中可以改變所有細胞的基因組,包括生殖細胞。因此,這種方法造成的基因組改造可以遺傳到子代個體中,為消除家族性的遺傳疾病提供可能。上海生化細胞所的李勁松研究員首次報道用 Crispr/cas9 技術修復小鼠胚胎中引起疾病的突變基因。他們矯正了小鼠白內障顯性突變基因 Crygc。他們將 Cas9的信使 RNA 和靶向 Crygc 基因的 sgRNA 同時注射到受精卵中,修復時以同源染色體上正常的基因做模板,進行同源重組修復,*后矯正了的小鼠的白內障[13]。另一項研究用 Crispr/Cas9 在小鼠胚胎中矯正肌萎縮蛋白基因,這種疾病是X染色體連鎖的遺傳性疾病[14]。在這項研究中,科研人員們同時注射Cas9 信使 RNA,sgRNA 和單鏈寡核苷酸片段一起到受精卵中進行HDR修復。盡管作者們只獲得了部分細胞得到矯正的嵌合體,是由于 DNA 編輯發生后受精卵分化的之后,通過自然選擇后依然得到了表型完全矯正的小鼠。在*近的一項研究中,研究人員用 Crispr/cas9 技術在人胚胎細胞中中進行了基因組編輯[15],引發了一些生物倫理方面的爭論[16, 17]。研究報道說在人胚胎的三原核合子中修改血紅素β基因,這個基因突變會造成地中海貧血癥。研究人員也發現了 Crispr/cas9 技術存在著脫靶風險,帶來很多不知道的 DNA 編輯,現在的技術用于臨床還存在風險,F有的產前檢測技術,比如體外受精后遺傳篩選可以篩選掉存在先生性疾病的胚胎。生殖細胞基因組編輯主要也為那些需要優化孩子一些性狀基因,如智商,相貌等等提供了可能。處于更多的安全和倫理問題,并不建議將 Crispr/cas9 技術用于人合子基因組編輯合法化。
               
               
               
              2.Crispr/cas9對體細胞的體內編輯
               
              Yin 等人運用 Crispr/cas9 技術成功地對出生后Ⅰ型酪氨酸血癥小鼠進行矯正[18]。Ⅰ型酪氨酸血癥在遺傳學上是由于缺少 fumarylacetoacetate hydrolase  ( FAH ) 酶引起的,導致肝細胞代謝毒物的積累而造成細胞死亡。通過尾靜脈注射 Cas9 載體,特異性的 sgRNA 和 DNA 模板在小鼠肝臟細胞進行同源重組修復。突變的 FAH 酶被矯正,肝細胞毒性減弱,小鼠的體重回升。酪氨酸血癥非常適合用 Crispr/cas9 系統進行基因治療,起初只有大約 0.4% 的肝細胞被矯正,后來通過肝細胞增殖和突變的肝細胞的死亡,整個肝臟機會恢復正常。
               
              另外一項體內研究是關于敲除小鼠肝臟細胞中 proprotein convertase subtilisin /kexin type 9 ( PCSK9 ) [19]。PCSK9從肝細胞中分泌到血漿中,作為低密度脂蛋白受體激動劑,它控制低密度脂蛋白的攝取與降解。天然出現的PCSK9 突變會減少血液中的膽固醇水平。為了模擬天然出現的情況,研究者用 Crispr/cas9 腺病毒載體在小鼠肝臟細胞中敲除 PCSK9。這導致 PCSK9 蛋白水平的降低和低密度脂蛋白受體的升高。更為重要的是,這種方法是通過NHEJ方法造成肝細胞PCSK9的突變,效率高達50%,這足夠用于臨床治療。
               
              Lin等人的研究證明了 Crispr/cas9 介導的基因組編輯同樣可以用于乙肝治療。許多乙肝病人,HBV的長期慢性感染導致肝硬化和肝癌[20]。盡管已經對乙肝病人的抗病毒治療有很多方法,仍不能徹底消除乙肝病人肝臟中的病毒。這是由于乙肝病毒基因組的復制中間體是一種類似質粒一樣的共價閉合環狀結構,非常穩定。在這項研究中,從小鼠的尾靜脈注射 HBV 表達載體來模擬乙肝病毒感染的情況,同時注射 Crispr/cas9 系統靶向 HBV 表達載體,發現HBV表達載體會被清除。在小鼠血液中乙肝病毒表面抗原濃度會減弱。由于這個小鼠模型還不是產生正常乙肝病毒感染情況下共價閉合環狀復制中間體,研究人員又在人的細胞系中感染鴨乙肝病毒,并用 Crispr/cas9 系統靶向病毒基因組,結果進一步證明 Crispr/cas9 的編輯作用完全可以徹底清除乙肝病毒。毫無疑問,任何殘留的病毒基因組都會使得病毒死灰復燃,重新感染。因此,發展高效的 Crispr/cas9 系統對臨床治療很多必要。
               
              在前面介紹臨床前的驗證研究都是在小鼠模型進行了 Crispr/cas9 進行基因治療。真正用于臨床治療還需要克服幾個問題。個問題是,提供 Crispr/cas9 系統的效率和安全性。在過去的20多年中,對傳統的外源表達載體用于基因治療研究很多[21, 22]。這些研究研發了很多病毒和非病毒基因治療載體,這對運送 Crispr/cas9 系統很有幫助。腺相關病毒穿梭載體由于它本身的高效率,適用細胞類型廣泛,低細胞毒性和低免疫原性而更具潛力。*新的研究可以把 Cas9和 sgRNA 放到一個腺相關載體中,他們將 Staphylococcus aureus 的小分子量 Cas9 克隆進去[23]。第二個問題是 Crispr/cas9 用于體內基因治療的話,相對于 NHEJ,HDR 低效率怎么解決?這限制了它應用于消除基因功能和矯正后增加細胞生存優勢的基因治療。解決這個問題的辦法是用配對的Cas9切口酶造成 DNA 單鏈斷裂,相對于 NHEJ,這會增加 HDR 修復的比例[24, 25]。第三個問題是 Crispr/cas9 用于疾病治療的的安全問題是它的脫靶效應[26, 27]。這些不需要的雙鏈斷裂會造成突變和染色體的重排。Crispr/cas9 脫靶問題還存在爭議,*近發明的全基因組分析方法可以控制它的脫靶問題[28-31]。這些分析方法表明 sgRNA 之間的脫靶概率相差很大,從零到 150 個位點。切割效率從 0.03% 到 87%。即使非常低的脫靶效應對于體內基因治療也是問題,如果是涉及到了腫瘤相關基因。因此,提高 Crispr/cas9 系統特異性尤為重要。兩項*近的研究表明在 sgRNA 5’端加上兩個 G [32]或者將 sgRNA 縮短到17個核苷酸[33]。用配對的 Cas9 切口酶造成DNA單鏈斷裂而不是引起雙鏈斷裂[34, 35],或者使用 dCas9-FokⅠ融合蛋白都可以大大減少脫靶突變效應[36, 37]。
               
              3.Crispr/cas9對體細胞的離體編輯
               
              活體外的基因編輯,需要先培養病人來源干細胞或者前體細胞,經過體外的基因組編輯后再回輸入病人體內。2007 年,山中伸彌發明了誘導人成纖維細胞變成多能干細胞[38]。誘導性多能干細胞可以無限增殖并可以分化成任何類型的細胞,這對離體的基因治療提供了可能。另外,過去的幾年中,研究人員建立了體外培養成體干細胞的實驗方法[39-41]。這種方法得到的干細胞并沒有去分化的步驟,也比誘導性多能干細胞更為安全。
               
              Crispr/cas9 離體的基因編輯的實驗性研究起始于用它對誘導性多能干細胞進行編輯,用來治療β珠蛋白生成障礙性貧血[42]。目前,治療β珠蛋白生成障礙性貧血的方法是回輸組織相容的健康捐獻者的造血干細胞。矯正病人來源的誘導性的多能干細胞為生產可移植的造血干細胞提供一個備選方案。研究人員從 β 珠蛋白生成障礙性貧血病人身上取下成纖維細胞,然后誘導成多能干細胞,轉染靶向性的 Crispr/cas9 和 DNA 模板進行 HDR 修復,同源重組修復通過抗性基因篩選,篩選后通過轉座酶切除,再將這樣的多能性干細胞誘導成紅細胞的前體細胞,然后用于移植。Hans Clevers 主持的一項研究證明 Crispr/cas9 系統可用于原代的成體干細胞的基因組編輯。在體外培養的小腸類器官模型中,可以無限地擴增多能腸干細胞,然后用 Crispr/cas9 矯正囊腫性纖維化[43]。囊腫性纖維化是一種單基因性遺傳病,是由于 CFTR 基因突變后造成胃腸道,肺支氣管的粘液積累造成一定的癥狀,如呼吸困難,反復感染。 分離培養了囊腫性纖維化病人的腸隱窩,在體外三維培養成類器官,然后轉染進 靶向 CFTR 基因座的 Crispr/cas9 和 DNA 模板進行同源重組修復。 嘌呤霉素篩選后,通過測序和功能試驗證明成功矯正 CFTR 基因。進而又檢測了這個實驗出現的脫靶效應很少。
               
              兩個獨立的實驗室運用 Crispr/cas9 技術矯正 DMD 病人來源誘導性多能干細胞和永生化細胞系[44, 45]。DMD 是由于抗肌萎縮蛋白基因的突變,引起肌肉纖維結構的改變。失去這個基因的功能會使得肌肉纖維結構的改變,*終引起骨骼肌,呼吸和心肌的衰退。個實驗室用 Crispr/cas9 聯合 DNA 模板通過同源重組的方法恢復抗肌萎縮蛋白全長基因,原先的 DMD 病人的誘導性多能干細胞缺少第44位的外顯子。修復的誘導性多能干細胞通過篩選后可誘導分化成表達野生抗肌萎縮蛋白基因的骨骼肌細胞。第二個實驗室在 DMD 病人來源的成心肌細胞系中缺失單個或多個外顯子恢復抗肌萎縮蛋白的讀碼框。多重基因編輯可以建立一個缺失突變熱點的 45 到 55 位外顯子,幾乎 60% 的 DMD病人都時基因突變發生在該區域。這種缺失修復后,無論在體外還是在移植到小鼠體內都能回復抗肌萎縮蛋白的表達。
               
              *后,另外一項基于 Crispr/cas9 技術的離體基因編輯研究處理 HIV 感染[46]。HIV感染的周期是先整合到宿主的免疫細胞T細胞基因組中,然后作為模板進行病毒復制。如果基因組轉錄沉默會導致潛伏感染。由于病毒潛伏在長壽命的記憶性T細胞中,即使存在著抗逆轉錄病毒的藥物,感染會無限地持續。運用基因組編輯技術,研究人員近來用了兩種方案對針對 HIV 潛伏感染,病毒基因組被核酸酶靶向后消除整合在T細胞基因組中的HIV病毒 DNA ;谶@項研究,*近在原代艾滋病人的 CD4 陽性T細胞中,用 Crispr/cas9 系統靶向高度保守的 HIV 病毒 TLR 區域后,發現病毒的產生和潛在感染源得到消除。研究人員又進一步證明了,經過靶向 TLR 的 Crispr/cas9 的 HIV 可感染細胞,而這樣的細胞是從誘導性多能干細胞分化而來的,可以抵抗新的 HIV 感染。另一個方法是,通過基因組編輯去除賦予 HIV 病毒抵抗性的 CCR5 受體,它是HIV感染T細胞的輔助性受體。Mandal 等人用 Crispr/cas9 編輯技術敲除 CD341 陽性造血干細胞上的 CCR5 [47]。他們用靶向性 CCR5 的 Crispr/cas9 載體轉染 CD341 陽性造血干細胞,敲除效率大約為 30%。同時,他們也證明敲除 CCR5 的多能造血干細胞移植到小鼠體內,仍保持分化成多個血液系統細胞的潛能,很少脫靶。更為重要的是,鋅指核酸酶靶向的 CCR5 已經成功地在臨床上通過試驗[48]。
               
              4.展望
               
              離體的基因治療的優勢在于可以體外篩選和分析矯正的細胞。因此,只有被矯正而又沒有脫靶的細胞才會被選擇回輸進病人體內。由于有篩選檢測的過程,離體情況下的 Crispr/cas9 介導的基因組編輯的效率和精確性比起直接體內操作要求顯得寬松一些。缺點在于,離體編輯需要通過體外培養擴增細胞,在培養過程中可能會造成基因組的改變。誘導性多能干細胞在重編程和擴增過程中容易積累突變和發生 CNV [49, 50]。盡管*近的研究表明體外三維培養的成體干細胞遺傳穩定性很高,但是體外細胞擴增仍然存在安全問題。離體基因治療的另外一個問題是高效的移植正確的細胞,F在已經在臨床上有很成熟造血干細胞移植的技術,但是其它組織,如肝和肌肉細胞移植技術還在改進中。毫無疑問,盡管存在這么多問題,這么多障礙, Crispr/cas9 技術仍然是臨床基因治療的巨大期望,未來會有翻天覆地的變化。
               
              參考文獻
               
              1. Wiedenheft, B., S.H. Sternberg, andJ.A. Doudna, RNA-guided genetic silencingsystems in bacteria and archaea. Nature, 2012. 482(7385): p. 331-338.
               
              2. Doudna, J.A. and E. Charpentier, The new frontier of genome engineering withCRISPR-Cas9. Science, 2014. 346(6213):p. 1258096.
               
              3. Jinek, M., et al., A programmable dual-RNA–guided DNAendonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 2012. 337(6096): p. 816-821.
               
              4. Mali, P., et al., RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science, 2013. 339(6121): p. 823-826.
               
              5. Barnes, D.E., Non-homologous end joining as a mechanism of DNA repair. Currentbiology, 2001. 11(12): p. R455-R457.
               
              6. Bosch, M.v.d., P.H. Lohman, and A.Pastink, DNA double-strand break repairby homologous recombination. Biological chemistry, 2002. 383(6): p. 873-892.
               
              7. Joung, J.K. and J.D. Sander, TALENs: a widely applicable technology fortargeted genome editing. Nature reviews Molecular cell biology, 2013. 14(1): p. 49-55.
               
              8. Urnov, F.D., et al., Genome editing with engineered zinc fingernucleases. Nature Reviews Genetics, 2010. 11(9): p. 636-646.
               
              9. Cho, S.W., et al., Targeted genome engineering in human cellswith the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature biotechnology, 2013. 31(3): p. 230-232.
               
              10. Cong, L., et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science,2013. 339(6121): p. 819-823.
               
              11. Wang, H., et al., One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes byCRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell, 2013. 153(4): p. 910-918.
               
              12. Niu, Y., et al., Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediatedgene targeting in one-cell embryos. Cell, 2014. 156(4): p. 836-843.
               
              13. Wu, Y., et al., Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9.Cell stem cell, 2013. 13(6): p.659-662.
               
              14. Long, C., et al., Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9–mediatedediting of germline DNA. Science, 2014. 345(6201): p. 1184-1188.
               
              15. Liang, P., et al., CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes.Protein & cell, 2015. 6: p.363-372.
               
              16. Cyranoski, D., Ethics of embryo editing divides scientists. Nature, 2015. 519(7543): p. 272-272.
               
              17. Lanphier, E., et al., Don't edit the human germ line. Nature,2015. 519(7544): p. 410.
               
              18. Yin, H., et al., Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation andphenotype. Nature biotechnology, 2014. 32(6):p. 551.
               
              19. Ding, Q., et al., Permanent alteration of PCSK9 with in vivo CRISPR-Cas9 genome editing.Circulation research, 2014. 115(5):p. 488-492.
               
              20. Lin, S.-R., et al., The CRISPR/Cas9 system facilitates clearance of the intrahepatic HBVtemplates in vivo. Molecular Therapy—Nucleic Acids, 2014. 3(8): p. e186.
               
              21. Mingozzi, F. and K.A. High, Therapeutic in vivo gene transfer forgenetic disease using AAV: progress and challenges. Nature reviewsgenetics, 2011. 12(5): p. 341-355.
               
              22. Kay, M.A., State-of-the-art gene-based therapies: the road ahead. NatureReviews Genetics, 2011. 12(5): p.316-328.
               
              23. Ran, F.A., et al., In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature,2015. 520(7546): p. 186-191.
               
              24. Ran, F.A., et al., Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editingspecificity. Cell, 2013. 154(6):p. 1380-1389.
               
              25. Osborn, M.J., et al., Fanconi anemia gene editing by theCRISPR/Cas9 system. Human gene therapy, 2014. 26(2): p. 114-126.
               
              26. Pattanayak, V., et al., High-throughput profiling of off-target DNAcleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Naturebiotechnology, 2013. 31(9): p.839-843.
               
              27. Fu, Y., et al., High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleasesin human cells. Nature biotechnology, 2013. 31(9): p. 822-826.
               
              28. Frock, R.L., et al., Genome-wide detection of DNA double-strandedbreaks induced by engineered nucleases. Nature biotechnology, 2015. 33(2): p. 179-186.
               
              29. Tsai, S.Q., et al., GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage byCRISPR-Cas nucleases. Nature biotechnology, 2015. 33(2): p. 187-197.
               
              30. Kim, D., et al., Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effectsin human cells. Nature methods, 2015. 12(3):p. 237-243.
               
              31. Crosetto, N., et al., Nucleotide-resolution DNA double-strandbreak mapping by next-generation sequencing. Nature methods, 2013. 10(4): p. 361-365.
               
              32. Cho, S.W., et al., Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guidedendonucleases and nickases. Genome research, 2014. 24(1): p. 132-141.
               
              33. Fu, Y., et al., Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.Nature biotechnology, 2014. 32(3):p. 279-284.
               
              34. Kim, E., et al., Precision genome engineering with programmable DNA-nicking enzymes.Genome research, 2012. 22(7): p.1327-1333.
               
              35. Mali, P., et al., CAS9 transcriptional activators for target specificity screening andpaired nickases for cooperative genome engineering. Nature biotechnology,2013. 31(9): p. 833-838.
               
              36. Tsai, S.Q., et al., Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genomeediting. Nature biotechnology, 2014. 32(6):p. 569-576.
               
              37. Guilinger, J.P., D.B. Thompson, and D.R.Liu, Fusion of catalytically inactiveCas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification.Nature biotechnology, 2014. 32(6):p. 577.
               
              38. Takahashi, K., et al., Induction of pluripotent stem cells fromadult human fibroblasts by defined factors. cell, 2007. 131(5): p. 861-872.
               
              39. Huch, M., et al., Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult humanliver. Cell, 2015. 160(1): p.299-312.
               
              40. Csaszar, E., et al., Rapid expansion of human hematopoietic stemcells by automated control of inhibitory feedback signaling. Cell stemcell, 2012. 10(2): p. 218-229.
               
              41. Sato, T., et al., Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma,adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology, 2011. 141(5): p. 1762-1772.
               
              42. Xie, F., et al., Seamless gene correction of β-thalassemia mutations in patient-specificiPSCs using CRISPR/Cas9 and piggyBac. Genome research, 2014. 24(9): p. 1526-1533.
               
              43. Schwank, G., et al., Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 inintestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell stem cell,2013. 13(6): p. 653-658.
               
              44. Li, H.L., et al., Precise correction of the dystrophin gene in duchenne musculardystrophy patient induced pluripotent stem cells by TALEN and CRISPR-Cas9.Stem cell reports, 2015. 4(1): p.143-154.
               
              45. Ousterout, D.G., et al., Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editingfor correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy.Nature communications, 2015. 6.
               
              46. Liao, H.-K., et al., Use of the CRISPR/Cas9 system as anintracellular defense against HIV-1 infection in human cells. Naturecommunications, 2015. 6.
               
              47. Mandal, P.K., et al., Efficient ablation of genes in humanhematopoietic stem and effector cells using CRISPR/Cas9. Cell stem cell,2014. 15(5): p. 643-652.
               
              48. Tebas, P., et al., Gene editing of CCR5 in autologous CD4 T cells of persons infected withHIV. New England Journal of Medicine, 2014. 370(10): p. 901-910.
               
              49. Ji, J., et al., Elevated coding mutation rate during the reprogramming of human somaticcells into induced pluripotent stem cells. Stem cells, 2012. 30(3): p. 435-440.
               
              50. Gore, A., et al., Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells.Nature, 2011. 471(7336): p. 63-67.
               

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